论文部分内容阅读
背景与目的糖皮质激素广泛用于抗过敏和自身免疫性疾病及器官移植后免疫抑制等方面的治疗,在取得显著疗效的同时也带来了高血压、糖尿病和骨质疏松等副作用。其中类固醇性糖尿病是最严重的副作用之一,在临床上很常见,但其确切的发病机理尚不清楚。糖皮质激素可通过多种途径降低外周组织对葡萄糖的摄取和利用,如促进肝脏中的糖原异生,抑制胰岛素与其受体的结合,抑制葡萄糖转运子-4向细胞膜的移位与锚着等。近年来的研究还表明糖皮质激素对胰岛功能可能还存在损伤作用。此外,葡萄糖刺激后的胰岛素释放,也可因大量糖皮质激素的存在而被抑制。但临床上发现皮质醇增高时,胰岛素分泌并未下降,提示更复杂的机理参与了类固醇性糖尿病的发生。过氧化物酶体增殖体激活受体(Peroxisome Proliferator Activatived Receptors,PPARs)属于Ⅱ型核受体超家族中的一员。噻唑烷二酮类化合物(Thiazolidinediones, TZDs):吡格咧酮(Pioglitazone)、罗格咧酮(Rosglitazone)等是PPARγ的合成型配体,通过与PPARγ结合,发挥增加肝脏和肌肉胰岛素敏感性的作用,可用于类固醇性糖尿病的治疗。Armando研究小组在动物实验水平发现PPARs激动剂罗格咧酮和吡格咧酮的抗炎作用可被GR拮抗剂RU486阻断,并于2005年通过细胞培养进一步发现TZDs可通过不依赖于PPARs的途径激活糖皮质激素受体核转位而起到抗炎的作用,Lemberger等的研究表明糖皮质激素拮抗剂(RU486)可阻断糖皮质激素对PPARα的基因表达的刺激作用,而PPARα在脂代谢中发挥重要作用。另有多项研究均可证明两者在抗炎及促进脂肪细胞分化的作用途径中存在交互影响。而PPARγ和GR同属核受体家族,TZD的非PPARs依赖性对糖皮质激素的影响作用除了上述作用外,是否有拮抗糖皮质激素对糖代谢影响的作用呢?本研究采用地塞米松、吡格列酮与肝细胞株共同培养,了解地塞米松在细胞水平对肝脏糖代谢和胰岛素生物效应的影响,并观察吡格列酮在该过程中能否发挥拮抗作用,进一步明确地塞米松影响肝细胞糖代谢以及吡格列酮干预作用的分子机制,为临床上预防和治疗类固醇性糖尿病提供了理论依据。方法1. HepG2细胞分为两组,对照组和地塞米松组(1umol/L),并各设亚组,分别温育24h,36h,48h,GOD-POD法测上清葡萄糖浓度,确定升高细胞葡萄糖浓度最明显的地塞米松作用时间。2.将HepG2细胞分为五组(Ⅰ-Ⅴ),分别为对照组(未加药培养基),地米组(1umol/L),地米+胰岛素组(胰岛素终浓度为10-9mol.L-1),地米+吡格列酮组(吡格列酮终浓度10umol·L-1),地米+胰岛素+吡格列酮组,先加地塞米松预先作用上述已确定的影响细胞葡萄糖浓度最明显的地塞米松作用时间,各组再加入对应药物共同温育24h,观察吡格列酮在该条件下对糖代谢糖原合成、糖异生及糖酵解各途径的干预作用。各项观察指标的测定：(糖原合成：糖原含量／蛋白含量(umol·mg-1),糖异生：葡萄糖生成量／蛋白含量(umol·mg-1),糖酵解：乳酸生成量／蛋白量(mmol·mg-1)和丙酮酸激酶活力／蛋白量(mU·mg-1))。3.将HepG2细胞分为四组：对照组,地塞米松组,RU486组,地塞米松+RU486组,上述四组细胞各设亚组,温育时间分别为24h,48h,GOD-POD法测上清葡萄糖浓度以确定RU486阻断GR的最佳时间。再将HepG2细胞分为六组：对照组,地米组,吡格列酮组,RU486组,RU486+地米组,RU486+吡格列酮组,共同温育上述已确定的RU486发挥作用的最佳时间,用GOD-POD法测各组细胞中葡萄糖浓度,观察PPARγ和GR在肝细胞糖代谢之间是否存在交互作用。结果1.地塞米松(浓度为1μmol/L)作用时间为48h时,较对照组细胞葡萄糖浓度升高最明显(22.03±0.60vs16.67±0.47,P<0.05)。2.给予地塞米松作用后,地塞米松组较对照组细胞葡萄糖浓度明显升高(22.03±0.60vs16.67±0.47,P<0.05),糖原含量明显下降(6.31±0.48 vs 12.27±0.81, P<0.05),糖异生量明显增加(16.59±0.97vs12.61±1.22, P<0.05),细胞乳酸生成量明显下降(15.35±1.02 vs 26.21±1.65, P<0.05),丙酮酸激酶活力有所下降,但差异无统计学意义(102.6±12.47vs156.1±17.43, P>0.05)。给予吡格列酮作用后：①葡萄糖消耗：地塞米松+吡格列酮组较地塞米松组细胞葡萄糖浓度有所下降(18.58±0.20 vs22.03±0.60,P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰岛素组较地塞米松+胰岛素组和地塞米松+吡格列酮组细胞葡萄糖浓度均可进一步下降,但差异无明显统计学意义(17.91±0.25vs18.03±0.36,17.91±0.25vs18.58±0.20,P>0.05)。②糖原合成：地塞米松+吡格列酮组较地塞米松组细胞糖原合成增加(15.06±0.79vs6.31±0.48, P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰岛素组较地塞米松+吡格列酮组细胞糖原合成进一步增加(20.01±0.73 vs15.06±0.79,P<0.05),但较地塞米松+胰岛素组糖原合成量差异无统计学意义(20.01±0.73vs19.15±0.94,P>0.05)。③糖异生量：地塞米松+吡格列酮组较地塞米松组细胞糖异生量明显下降(4.88±0.47vs16.59±0.97, P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰岛素组较地塞米松+胰岛素组细胞糖异生量进一步下降(3.21±0.42 vs 10.22±0.91, P<0.05),但较地塞米松+吡格列酮组差异无统计学意义(3.21±0.42vs4.88±0.47,P>0.05)④糖酵解：地塞米松+吡格列酮组较地塞米松组细胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力较地塞米松组有所增加,但差异无统计学意义(乳酸生成量：19.43±1.16vs15.35±1.02,P>0.05；丙酮酸激酶活力：133.2±15.06 vs 102.6±12.47,P>0.05),地塞米松+吡格列酮+胰岛素组较地塞米松组和地塞米松+吡格列酮组细胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力均明显升高(乳酸生成量：39.53±2.32vs15.35±1.02,39.53±2.32vs 19.43±1.16, P<0.05;丙酮酸激酶活力：232.5±25.17 vs 102.6±12.47,232.5±25.17 vs 133.2±15.06,P<0.05),但较地塞米松+胰岛素组乳酸生成量增加(39.53±2.32vs30.63±1.75, P<0.05),丙酮酸激酶活力差异无统计学意义(232.5±25.17vs21 2.4±18.47,P>0.05)。3.RU486(10 umol·L-1)作用时间为24h时,各组细胞葡萄糖浓度差别无统计学意义(P>0.05)。作用时间为48h时,对照组、RU486组和RU486+地米组三组细胞上清葡萄糖浓度无统计学差异(P>0.05),但较地塞米松组葡萄糖浓度均明显降低,差别有统计学意义(16.67±0.47vs22.03±0.60,15.54±0.35vs22.03±0.60,17.69±0.33 vs 22.03±0.60, P<0.05),由此确定RU486在该浓度下阻断了地塞米松的升糖作用时间为48h。在此基础上,RU486+吡格列酮组较吡格列酮组细胞上清葡萄糖浓度升高,差异有统计学意义(分别为：18.50±0.82 vs 14.23±0.92,P<0.05)。结论1.地塞米松作用于肝细胞使其葡萄糖摄取能力下降。2.吡格列酮在地塞米松作用的肝细胞糖代谢中主要通过促进糖原合成和抑制糖异生发挥干预作用,并具有胰岛素增敏剂的作用。3. PPARγ和GR在肝细胞糖代谢方面可能存在相互作用：地塞米松可能没有通过GR以外的PPARγ途径发挥作用。吡格列酮可能通过PPARγ以外的GR发挥了部分降糖的作用,当GR被阻断时同时也阻断了吡格列酮的该部分降糖作用。