【摘 要】
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目的:（1）兔来源骨髓间充质干细胞的分离提取及鉴定;（2）四面体DNA纳米结构构建及与骨髓间充质干细胞共培养探究细胞功能及成骨分化的影响。材料与方法:（1）兔来源骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离提取与鉴定:采取全骨髓贴壁培养法分离并纯化目的细胞,观察培养过程中细胞形态,并绘制生长曲线图;通过流式细胞术检测细胞表面抗原、诱导成骨分化后茜素红染色进行细胞类型鉴定。（2）（1）四面体DNA纳米结构的
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目的:（1）兔来源骨髓间充质干细胞的分离提取及鉴定;（2）四面体DNA纳米结构构建及与骨髓间充质干细胞共培养探究细胞功能及成骨分化的影响。材料与方法:（1）兔来源骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离提取与鉴定:采取全骨髓贴壁培养法分离并纯化目的细胞,观察培养过程中细胞形态,并绘制生长曲线图;通过流式细胞术检测细胞表面抗原、诱导成骨分化后茜素红染色进行细胞类型鉴定。（2）（1）四面体DNA纳米结构的构建及表征:体外设计四条单链DNA,定量稀释为10μmol/L后,等摩尔浓度混合在TM缓冲液中,混匀后95℃充分变性10min,4℃20min,即可合成DNA纳米结构,合成后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以及投射电子显微镜（TEM）进行结构上的表征,已确认其是否成功合成,（2）四面体DNA纳米材料对兔骨髓间充质干细胞功能及向成骨分化影响的研究:四面体DNA合成后,实验分为四组,分别为无四面体DNA材料的对照组,四面体DNA材料浓度分别为62.5nmol/L、125nmol/L、250nmol/L的实验组,取骨髓间充质干细胞与不同浓度的四面体DNA材料共培养,研究不同浓度四面体DNA材料对骨髓间充质干细胞增殖的影响;选取增殖作用最明显的浓度作为后续实验组,对培养的干细胞分为两组,实验组加入含有该浓度四面体DNA纳米材料的成骨诱导培养基,对照组加入等量不含该材料的诱导培养基,共培养7天后,测定碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测成骨相关基因OPN、OCN、RUNX2的表达,Western blot检测成骨相关蛋白OPN、RUNX2及β-catenin的表达。结果:（1）兔来源骨髓间充质干细胞的分离提取与鉴定:可经全骨髓贴壁法成功体外分离培养干细胞;原代细胞培养10天后可见呈梭形的贴壁细胞,细胞间紧密融合,传代培养24小时后可基本全部贴壁,梭形细胞呈漩涡状排列,活性良好,生长曲线基本符合Logistic细胞生长曲线规律;骨髓干细胞经流式细胞术鉴定提示,CD14呈低表达,CD90高表达;骨髓干细胞成骨诱导分化染色可见明显矿化结节,提示所培养细胞确为骨髓间充质干细胞。（2）（1）四面体DNA纳米材料的构建及表征:体外合成的四条单链DNA混匀于TM缓冲液中,经一步退火法合成后,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,随着DNA链的增加,其迁移距离逐渐缩短,提示DNA链间相互配对,分子量逐渐增大;使用透射电子显微镜观察后可见三角形产物,以及DNA分子间聚集形成的大分子。（2）四面体DNA纳米材料对兔骨髓间充质干细胞功能及成骨分化影响的研究:四面体DNA合成后分为四组与骨髓干细胞共培养,通过CCK-8法检测后,可发现在共培养第1、3天时,62.5nmol/L、125nmol/L、250nmol/L的实验组相对于对照组均表现出促增殖作用（P＜0.05）,且浓度为250nmol/L时增殖作用最明显,故选取浓度为250nmol/L作为后续实验组;成骨分化诱导7天后收集细胞测定碱性磷酸酶活性显示,实验组碱性磷酸酶活性明显增高（P＜0.05）;实验组成骨相关基因OPN、OCN、RUNX2表达显著增高（P＜0.05）;实验组成骨相关蛋白OPN、RUNX2、β-catenin表达高于对照组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:（1）兔骨髓间充质干细胞可经全骨髓贴壁法培养,且活性良好;（2）四面体DNA纳米结构由四条单链DNA合成,核酸凝胶电泳及透射电镜可进行验证,与细胞共培养后,显著促进骨髓间充质干细胞的增殖及分化。
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