人源脱硫弧菌分离鉴定及硫酸盐还原菌群落宏基因组的初步分析

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硫酸盐还原菌(Sulphate-reducing bacteria,SRB)是一类广泛存在于厌氧环境,通过降解有机物获得能量,并把硫酸盐还原为硫化物的细菌的总称,是肠道内产生硫化氢(H2S)的主要细菌,在调节肠道组织稳态和炎症方面有重要作用,其中脱硫弧菌属(Desulfovibrio,DSV)丰度最高。本论文从6名健康志愿者(Healthy volunteers,HV)和6名肝硬化(Liver cirrhosis,LC)患者的粪便中分离鉴定DSV,并对其进行脱硫性能、产H2S能力、肠道定殖评价和抗生素敏感性的比较研究。其次探究了不同营养化学品对标准菌株:脱硫脱硫弧菌ATCC 29577(Desulfovibrio desulfuricans ATCC 29577)的影响。最后对HV来源的SRB群落进行了宏基因组的整体初步分析。主要工作如下:(1)分离鉴定人肠道DSV,并对其进行脱硫性能、产H2S能力、肠道定殖评价和抗生素敏感性的比较研究。本研究共从粪便样品中分离筛选出53株HV来源的和11株LC患者来源的DSV。其中LC患者来源的菌株均为D.desulfuricans。HV来源的菌株多数为D.desulfuricans,占分离菌株总体的54%,其次分别为D.intestinalis(15%)、D.simplex(11%)、D.piger(9%)、D.legallii(5%)、D.oxamicus(5%)和D.fairfieldensis(1%)。脱硫性能和产H2S能力的研究结果显示HV来源的DSV中,D.fairfieldensis(JN-SRB-45)和D.piger(JN-SRB-12、18、20、21、44)的脱硫性能和产H2S的能力最强,D.intestinalis(JN-SRB-3、4、7、9、23、37、49、50)次之,D.legallii(JN-SRB-32、40)和D.oxamicus(JN-SRB-5、14)最弱。LC患者来源的DSV整体上要强于HV来源的DSV。DSV肠道定殖评价结果显示HV来源的DSV中,D.fairfieldensis和D.piger更耐受人工胃液(Simulated gastric fluid,SGF)和人工肠液(Simulated intestinal fluid,SIF)。LC患者来源的DSV之间分别对SGF和SIF的耐受性无明显差异,且比HV来源的DSV更耐受SIF,因此也更容易在肠道定殖。DSV对抗生素的敏感性研究结果显示,DSV对甲硝唑和硫酸卡那霉素高度敏感。此外,除D.desulfuricans和D.fairfieldensis对氨苄西林不敏感,其他DSV分离菌株对氨苄西林也高度敏感。(2)探究不同营养化学品对D.desulfuricans ATCC 29577的影响。本研究选取的营养化学品中,低聚木糖、甘露寡糖和壳寡糖呈剂量依赖性抑制D.desulfuricans ATCC29577的生长。低聚木糖和甘露寡糖分别在1000~2000和500~2000μg/m L剂量范围内抑制作用明显(***p<0.001)。壳寡糖在500~2000μg/m L剂量范围内极显著抑制D.desulfuricans ATCC 29577的生长,在250μg/m L(***p<0.001)和125μg/m L(**p<0.01)剂量时抑制作用减弱。蝙蝠蛾拟青霉发酵滤液在500~2000μg/m L范围内对D.desulfuricans ATCC 29577有一定的剂量依赖性抑制作用。(3)SRB群落的宏基因组初步分析。我们通过处理HV来源的粪便样品,收集肠道菌并通过脱硫弧菌选择培养基继代培养10代,得到体外培养的SRB群落,并送宏基因组测序。测序结果显示SRB群落(n=5)在微生物组成结构上是相似的,门水平均以变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门为主,属水平主要以柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属、脱硫弧菌属、副拟杆菌属、梭杆菌属为主,群落共有微生物达77.78%。对SRB群落进行基因预测,平均预测到19154个基因。通过基因GO数据库和COG数据库注释发现丰度较高的基因和蛋白质主要集中在参与氨基酸转运和代谢,碳水化合物转运和代谢,能量的产生和转化以及无机离子的转运和代谢等方面,群落之间无明显差别。结果表示本研究中的肠道SRB群落在体外经过脱硫弧菌选择培养基多次继代培养一段时间后,群落结构趋于稳定,这为后续在群落水平上研究SRB提供了一定理论依据。
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