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目的明确TNF-α对肿瘤微环境中BMSCs生物学特性的影响以及相关分子机制。材料与方法1.实验动物本实验选取（40±10）g SD雄性大鼠（SPF级）,购自重庆医科大学所属的动物中心。2.实验细胞原代BMSCs于SD大鼠中提取。C6脑胶质瘤细胞系由重庆医科大学附属儿童医院肿瘤实验室惠赠。间充质干细胞与C6脑胶质瘤细胞通过Transwell小室构建非接触共培养模型。3.实验分组3.1共培养时间条件选择:收取第4-7天的共培养BMSCs,western blot检测NF-κB/P65的表达,从而选取最佳培养实验时间。3.2检测BMSCs及共培养细胞的TNF-α在上清及mRNA水平的表达。3.3 TNF-α浓度条件选择:共培养BMSCs中加入不同浓度TNF-α（0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）,培养7天后,收取细胞,western blot检测NF-κB/P65的表达,从而选取出适宜实验浓度。3.4具体分组,本实验分为4组:BMSCs组、共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组、共培养+5ng/ml TNF-α组。4.实验方法4.1流式细胞术检测BMSCs表面分子表达。4.2倒置显微镜下观察各组细胞形态变化。4.3 CCK8、流式细胞术、Transwell检测各组细胞增殖能力、细胞周期分布、迁移能力。4.4 RT-QPCR检测各组c-Myc、CyclinD1、TNFR1、Caspase3、Caspase8 mRNA水平的表达。4.5 Western blot检测各组NF-κB/P65、CyclinD1、c-Myc、Caspase3、p-Bad、P62、LC3II/LC3I蛋白表达。结果1.本实验提取的BMSCs CD29表达率为100%、CD90表达率为99.7%、CD34表达率为1.7%、CD45表达率为0.1%,阳性表达率>95%,阴性表达率<2%,符合BMSCs鉴定标准,可继续以下实验。2.第4天至第7天,共培养BMSCs中NF-κB/P65表达逐渐升高,第7天表达最高,与BMSCs比较有统计学意义（P<0.05）。故本实验选用共培养第7天为培养时间节点。3.共培养细胞的上清以及mRNA表达均低于BMSCs（P<0.05）。4.加入0.5ng/ml TNF-α的共培养BMSCs中NF-κB/P65表达与未加TNF-α的共培养BMSCs比较无统计学差异,从0.5ng/ml至5ng/ml TNF-α,随着TNF-α浓度增加,共培养BMSCs中NF-κB/P65表达逐渐降低,加入5ng/ml TNF-α时,NF-κB/P65表达最低,与未加TNF-α的共培养BMSCs比较有统计学差异（P<0.05）,故本实验选取0.5ng/ml、5ng/ml TNF-α作实验高低浓度。5.共培养组较BMSCs组形态更细长、核质比增大,有轻度异型性。共培养+0.5ng/ml TNF-α组细胞形态与共培养组较一致。共培养+5ng/ml TNF-α组细胞形态与BMSCs组较一致,但凋亡细胞增多。6.自第2天开始,共培养组增殖能力高于BMSCs组（P<0.05）,而共培养+5ng/ml TNF-α组增殖能力低于共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。7.共培养组G2+S期比例较BMSCs组表达增加（P<0.05）,共培养+5ng/ml TNF-α组G2+S期比例低于共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。8.BMSCs组细胞迁移数为21.67±3.79,共培养组细胞迁移数为66.33±6.03,共培养+0.5ng/ml TNF-α组细胞迁移数为59.00±3.61,共培养+5ng/ml TNF-α组细胞迁移数为20.67±5.13,共培养组细胞迁移数高于BMSCs组（P<0.05）,共培养+5ng/ml TNF-α组细胞迁移数低于共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。9.共培养组中c-Myc、CyclinD1 mRNA表达高于BMSCs组（P<0.05）,而共培养+5ng/ml TNF-α组中c-Myc、cyclinD1 mRNA表达低于共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。共培养+5ng/ml TNF-α组中TNFR1、Caspase3、Caspase8 mRNA表达高于BMSCs组、共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。10.共培养组中c-Myc、cyclinD1蛋白表达高于BMSCs组（P<0.05）,而共培养+5ng/ml TNF-α组中c-Myc、cyclinD1蛋白表达低于共培养组及共培养+0.5ng/ml TNF-α组（P<0.05）。共培养组p-Bad表达高于BMSCs组（P<0.05）,共培养+5ng/ml TNF-α组相较于共培养组,可下调抗凋亡蛋白p-Bad的表达（P<0.05）。共培养组较BMSCs组,可上调P62表达、下调LC3II/LC3I表达（P<0.05）,共培养+5ng/ml TNF-α组相较于共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组,可下调p62表达、上调LC3II/LC3I表达。结论1.骨髓间充质干细胞在肿瘤微环境中可发生增殖、周期、迁移等生物学特性的改变,可能通过上调NF-κB表达,诱导下游c-Myc、cyclinD1等蛋白表达增加,而加入适宜浓度的TNF-α有保护作用。2.适宜浓度的TNF-α可促进细胞凋亡、自噬相关蛋白表达,故推测凋亡、自噬能力的增加可能是BMSCs的保护机制之一。