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本研究检测了乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在肝癌组织和癌旁组织中的表达,通过稳定转染HBx基因的肝癌细胞,分析了HBx阳性肝癌细胞中HBx对HIF-1α的调节作用及机制,为HBv相关性肝癌的形成、发展及治疗提供一定的理论依据。
研究目的:
1、探讨HBx及HIF-1α在肝癌组织中的相关性及它们与肝癌病理特征的关系。
2、探讨稳定转染HBx基因的HepG2(HepG2-X)细胞中HBx对HIF-1α的调节作用3、探讨HepG2-X中HBx对HIF-1α的可能调节机制。
研究方法:
1、免疫组织化学染色检测原发性肝癌和癌旁组织标本中HBx和HIF-1α的表达;分析了二者的相关性及其阳性表达与患者的病理特征。
2、免疫荧光检测HepG2及HepG2-X中HIF-1α的表达;
3、West-blot检测正常氧和缺氧状态下HepG2及HepG2-X中HIF-1α表达,并分析HBx对HIF-1α的调节作用。
4、流式细胞术检测正常氧和缺氧状态下HepG2及HepG2-X细胞活性氧(ROS)的含量,并分析HBx调节HIF-1α的可能机制。
研究结果:
1、78例肝癌组织标本中,HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.23%(58/78)和69.23%(54/78);在同一标本切片中,两者表达有很好的符合性。将阳性结果评分后应用SPSS10.0统计学软件进行相关性分析:相关系数R=0.636,P<0.05,提示;二者之间呈正相关性。并且HBx和HIF-1α表达都和组织的分化程度相关(rs=-0.618,P<0.01;rs=-0.62,P<0.01),并且组织分化程度越高,HBx和HIF-1α表达越强,说明HBx和HIF-1α的表达与肝癌临床特征密切相关。
2、免疫荧光检测表明:正常氧状态下,HepG2中HIF-1α的表达阴性而HepG2-X中表达阳性主要位于细胞浆,部分位于细胞核。在缺氧状态下,HeptG2和HepG2-X的细胞质和细胞核均完全表达。
3、Western-blot法检测:在常氧状态下,HIF-1α在HepG2细胞中几乎无表达,而在HepG2-X细胞中显著表达。在缺氧状态下,HIF-α的表达表现为缺氧时间及低氧张力的依赖性。特别在缺氧的早期(<16小时),如在缺氧8h时,HIF-α在HeptG2-X中明显高于HepG2。
4、流式细胞术检测细胞ROS含量显示:在常氧状下,HepG2-X细胞中ROS含量明显高于HepG2细胞。在缺氧状态下,二者ROS含量无显著差异,但均明显高于常氧状态下HepG2细胞的ROS含量。
研究结论:
1、Hbx和HIF-1α在HBx诱导乙肝相关性肝癌中正性相关并发挥重要作用。(1)HBx及HIF-1α在人肝细胞肝癌组织中广泛表达,二者存在显著相关;(2)无论正常氧或缺氧状态下,HBx均可上调HIF-1α在HepG2-X中的表达;提示HIF-1α表达上调可能是HBx诱导乙肝相关性肝癌形成中的一个重要事件。
2、HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。(1)常氧状态下,HepG2-X中的ROS含量较HepG2细胞升高,这与HIF-1α在二者中的表达结果一致,提示常氧状态下,HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。(2)缺氧状态下的HepG2、HepG2-X及常氧状态下HepG2-X细胞三者ROS含量无明显的差别,但较常氧状态下HepG2的ROS含量显著增高,与同等条件下的HIF-1α表达结果一致,同样提示HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。