1.帕金森病的简介及发病机制帕金森病(Parkinson’s Disease)是一种在老年人中常见的中枢神经系统疾病,是发病率仅次于阿尔茨海默病的中枢神经系统退行性病变[1,2,3]。帕金森病的临床表现主要为静止性震颤(tremor at rest),运动迟缓(bradykinesia),僵直(Rigidity)等运动系统障碍。帕金森病的主要病理学改变包括：(1)以中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)为主的多巴胺能神经元(Dopamine, DA)的进行性丢失。(2)胞浆内包涵体物质即路易小体(Lewy bodies)的出现等[4]。近年来,广大学者通过大量研究逐渐对帕金森病的发病原因,临床表现,发病机制,疾病转归及治疗有了深入系统的认识。帕金森病是一种由多种因素共同作用所导致的综合性疾病,虽然目前帕金森病的发病机制尚未完全明了,但大量研究证实,遗传因素(如Pitx3, Nurr1, α-synuclein, parkin, PINK1, LRRK2等基因的异常表达),环境因素(如除草剂、鱼藤酮、MPTP等)氧化应激,铁离子含量增高,兴奋性中毒及炎症反应等在帕金森病的发病机制中起着重要作用[4,5,6,7,8,9]。近年来,大量研究证实泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System)功能异常导致的错构蛋白聚集也在帕金森病发病机制发挥着重要的作用[10]。2. Nurr1(NR4A2)基因在帕金森病中的作用Nurr1基因是属于核受体超家族的转录因子,由Law等于1992年首次在小鼠脑cDNA文库中发现[11]。随后Mages等从外周血T细胞分离出人Nurrl基因并应用多态性连锁分析将其定位于2q22-q23[12]。Nurr1基因包含8个外显子,开放阅读框起始于外显子的第三个核苷酸-腺嘌呤,终止密码子位于外显子8。Nurrl基因主要表达于中枢神经系统,在黑质(SN),被盖腹侧(VTA),中脑,嗅球,海马,颞叶皮层,小脑,下丘脑后部和边缘系统呈现高表达[13,14,15]。大量研究发现,Nurrl在中脑多巴胺能神经元的发育,迁移和存活中发挥着重要的作用[16,17]。Zetterstrom等还研究发现Nurrl基因缺乏的小鼠(Nurr1-/-)由于运动功能障碍及不能吸吮,出生后24小时内即死亡。组织病理学分析显示,中脑黑质及腹侧被盖区的多巴胺能神经元数量明显减少[16]。在Nurrl基因缺失的杂合子小鼠(Nurr1+/-)研究中发现,其对于乳胞素(lactacystin)所引起的黑质损伤的易感性明显增加[18]。老年(大于15个月)的Nurr1+/-小鼠的运动功能较之同龄野生型小鼠显著降低,中脑黑质内多巴胺能神经元显著减少[19,20]。Le等还在人体外周血淋巴细胞中检测发现,较之正常对照人群,其Nurr1基因表达水平在帕金森病和帕金森综合症患者中显著降低[21,22,23]。综上所述,Nurr1基因是中枢神经系统非常重要的转录因子,在中脑多巴胺能神经元的发育过程发挥着重要的作用,使得Nurr1基因可以作为帕金森病治疗新策略中的潜在靶点。本次实验的第一部分即在帕金森病小鼠动物模型中应用一种Nurr1基因激活剂Compound1,通过对比应用Nurr1基因激活剂Compound1与否的小鼠中脑多巴胺能神经元数量,行为学数据,生化检查等指标,衡量此种Nurr1基因激活剂的生物活性及其在帕金森病动物模型中的神经保护作用。3.帕金森病模型的建立为了直观测定实验药物(Nurr1基因激活剂Compound1)的治疗效果,我们需要构建帕金森病动物模型进行体内实验研究。乳胞素(lactacystin)是一种高选择性的泛素-蛋白酶体抑制剂,通过抑制或破坏泛素蛋白酶体系统的作用,导致错构蛋白不能被降解并最终导致多巴胺能神经元的功能障碍和死亡[24]。在前期实验中,我们已经证实直接向小鼠内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB)立体定向注射乳胞素(lactacystin)会使其产生类似于帕金森病的神经病理特性：中脑多巴胺神经元的显著丧失以及包涵体样蛋白的聚集。此外,我们还发现小鼠纹状体内的多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)及二羟苯乙酸(DOPAC)的含量水平明显下降,而5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量变化不明显,论证了乳胞素(1actacystin)高度选择性的作用于黑质-纹状体多巴胺通路。4. Pitx3基因在帕金森病中的作用Pitx3是垂体同源盒家族成员,是一种同源域包含转录因子[25]。小鼠动物试验中研究发现,Pitx3在小鼠胚胎期可在骨骼肌和晶状体中短暂表达,而小鼠出生后Pitx3仅特异性的表达在中脑的SNc区和VTA区,与TH几乎同时表达,在中脑多巴胺能神经元的发育和成熟过程中发挥着重要作用[26,27]。Pitx3基因敲除小鼠(Pitx3-/-,无晶状体小鼠)较之野生型小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元数量显著减少,小鼠运动能力显著减弱[28]。我们近期研究发现,Pitx3还是影响黑质纹状体多巴胺能神经元中BDNF和GDNF表达的重要介质[29]。虽然目前多数研究发现Pitx3和Nurr1基因以不同的通路影响多巴胺能神经元的发育,但最新研究发现,在多巴胺能发育的过程中,Nurr1基因的转录活性能够被SMRT抑制,而Pitx3能够通过降低SMRT的抑制作用来增强Nurr1基因的活性[30]。我们实验的第二部分即应用Pitx3基因缺失小鼠(Pitx3-/-)与Nurrl基因敲除杂合子小鼠(Nurrl+/-)杂交获得的同时拥有Pitx3和Nurr1基因缺失的小鼠(Nurr1+/-Pitx3-/-),通过一系列免疫及生化等试验方法,测定其是否与单独Pitx3和Nurr1基因缺失小鼠在运动协调能力,多巴胺能神经元数量,DA和5-HT及其代谢物含量等指标上有区别。5.小结本论文的实验部分是在山东大学与美国贝勒医学院(Baylor College of Medicine)神经科学研究所进行博士生联合培养期间完成的。本文将严谨、充分的实验结果与帕金森病的研究现状相结合,通过在帕金森病动物模型上应用Nurr1基因激活剂(Compound1),研究论证了其在帕金森病中的神经保护作用。本实验结论以期能为将来中枢神经系统退行性病变的基因治疗提供理论依据和实验基础。第一部分Nurrl基因激活剂在帕金森病模型中的神经保护机制研究研究目的应用高选择性蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin)建立帕金森病(PD)动物模型,观察Nurrl基因激活剂(Compound1)在此帕金森病模型中的作用。通过分析应用Compound1与否动物模型的行为学改变(疲劳转棒测试及自主活动测试),免疫病理学改变(中脑黑质致密区多巴胺能神经元数量),纹状体内生化改变(5-羟色胺,多巴胺及其代谢物)及中脑组织内Nurr1及其相关基因的mRNA水平变化来明确Compound1的神经保护作用。研究方法将8周龄的雄性C57BL/6小鼠按照随机原则分为4组：对照组,lactacystin处理组,lactacystin plus Compound1组,lactacystin plus Compound2(对照药物)组。在对小鼠内侧前脑束(MFB)立体定向注射lactacystin的前1天以及注射过后第7天,14天,21天,28天进行行为学测试,并于第28天处死小鼠,快速取出小鼠的脑组织分别进行-80℃低温保存和免疫组化处理,测定中脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)阳性细胞数,多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及其代谢物DOPAC, HVA及5-HIAA的含量,中脑小胶质细胞活性,中脑组织内Nurr1、DAT、Vmat2的mRNA水平变化。结果(1)相较对照组,内侧前脑束(MFB)注射lactacystin的小鼠运动能力显著降低,(P<0.01,P<0.05),中脑黑质TH阳性细胞数明显减少(P<0.01,P<0.05),中脑黑质内小胶质细胞活性明显增加(P<0.01),纹状体DA, DOPAC,HVA含量显著减少(P<0.01,P<0.05)。(2)较之lactacystin组,Compound1处理组显著提高了小鼠的运动能力,增加了中脑黑质区的TH阳性细胞数,降低了中脑黑质区小胶质细胞活性,提高了中脑组织中Nurr1, DAT, Vmat2的表达水平(P<0.01,P<0.05),同时显著提升了纹状体DA, DOPAC, HVA的含量,具有明显的神经保护作用。(3)与Compound1处理组相比,Compound2处理组未显示明显的神经保护作用。结论(1)内侧前脑束(MFB)区注射蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin)能够表现大部分帕金森病的特点,可以作为本研究的帕金森病动物模型。(2) Nurr1基因激活剂Compound1能够显著提高中脑组织中Nurr1及其相关基因的表达水平,减轻乳胞素(lactacystin)对小鼠模型多巴胺能神经元损害,具有明显的神经保互作用。第二部分Pitx3和Nurr1基因缺失在多巴胺能神经元发育及功能维持中的协同作用研究目的Pitx3基因和Nurr1基因在中脑多巴胺能神经元发育过程中起着重要的调节作用。近期研究显示,二者在多巴胺能神经元发育过程中相互影响,Pitx3能够通过降低SMRT的抑制作用来增强Nurr1基因的活性。本研究旨在通过比较Nurr1与Pitx3基因同时缺失小鼠(Nurr1+/-Pitx3-/-)和|Pitx3基因缺失小鼠(无晶状体小鼠,Pitx3-/-)以及单Nurr1基因敲除杂合子小鼠(Nurr1+/-)之间的行为学、免疫病理学及生化等方面的差异,研究三种不同基因型小鼠在运动功能,中脑多巴胺能神经元数量及功能等发面的差异。研究方法将小鼠按照不同的基因型分为四组：野生型小鼠组(Wild type, WT,对照组),Pitx3基因缺失组(无晶状体小鼠,Pitx3-/-), Nurr1基因敲除杂合子小鼠组(Nurr1+/-), Pitx3和Nurr1基因同时缺失组(Nurr1+/-Pitx3-/-).对四组小鼠分别于出生后30天,60天进行行为学测试,并于小鼠出生后第60天将小鼠过量麻醉处死,快速取出小鼠脑组织分别进行免疫组化处理,生化及Rea1-time PCR检测,测定中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数,多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及其代谢物DOPAC, HVA及5-HIAA的含量,脑组织中Pitx3,Nurr1,TH,DAT,VMAT2,BDNF,GDNF等指标mRNA的表达水平变化。结果(1)较之野生型小鼠,Pitx3基因缺失(Pitx3-/-)的小鼠运动能力,中脑TH阳性细胞数,DA, DOPAC和HVA含量以及TH.DAT基因mRNA表达水平显著降低(P<0.01,P<0.05)。(2)与单独Pitx3基因缺失(Pitx3-/-)和单独Nurrl基因缺失(Nurr1+/-)小鼠相比,Pitx3和|Nurr1基因同时缺失(Nurr1-/-Pitx3-/-)的小鼠运动能力,中脑黑质区TH阳性细胞数,DA, DOPAC和HVA含量以及及TH.DAT基因mRNA表达水平显著降低(P<0.01,P<0.05)。(3)与Nurr1+/-小鼠相比,Nurr1基因mRNA表达水平在Nurr1+/-Pitx3-/-小鼠中显著降低(P<0.05)。结论(1)Pitx3和Nurr1在中脑多巴胺能神经元的发育过程及功能维持中发挥着重要的作用。(2)Nurr1-/-Pitx3-/-小鼠与Nurrl+/-小鼠和Pitx3-/-小鼠相比中脑多巴胺能神经元明显丢失,Nurr1基因和]Pitx3基因在多巴胺能神经元发育及功能维持中有协同作用。