汉坦病毒(Hantavirus, HV)属于布尼亚病毒科,是分节段的单股负链RNA病毒。其基因组分为大(Large, L)、中(Medium, M)和小(Small, S)三个片段,分别编码核蛋白,糖蛋白(Gn, Gc)和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白。人可通过直接或间接接触宿主动物的排泄和分泌物等感染汉坦病毒,引起以肾脏损害为主的肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS)和以肺毛细血管通透性增高以及心血管受累为主的汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome, HPS),全世界有将近30多个国家每年持续有汉坦病毒感染报告病例,我国肾综合征出血热疫情最为严重,近十年以来年均发病人数一万左右。目前,已确定的汉坦病毒血清型达30余种,而引起我国上述传染病的汉坦病毒主要为汉滩型病毒(Hantaan virus, HTNV)和汉城型病毒(Seoul virus, SEOV)。陕西省是我国受汉坦病毒影响十分严重的两型病毒混合疫区,但针对宿主动物和感染人群的血清学研究显示,该地区主要以汉滩型病毒流行为主,当地每年肾综合征出血热的报告病例都居全国前列,发病高峰集中在每年的冬春两季,其中春季的3-5月一般为发病小高峰,而发病大高峰一般集中在冬季,开始于每年的11月份左右,结束于次年的1月份。因此,基于上述流行病学特征,我们选择于2014冬季在西安地区进行肾综合征出血热患者全血采集工作。目前,汉坦病毒的分离难度仍较大,并且现阶段大部分汉坦病毒分离株来源于宿主动物样本,而分离自人外周血的毒株尚较少,近十年来西安地区也仅有从黑线姬鼠鼠肺中分离到汉坦病毒。因此为提高汉坦病毒分离率,本研究尝试从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中进行汉坦病毒分离,并通过分析病毒分离株的基因组特征,为进一步研究宿主来源与HFRS病人来源毒株的相关性提供依据。本研究于2014年11月至2015年1月肾综合征出血热高发时间段,在陕西省西安市第八医院采集HFRS患者抗凝血及血清样本,其中共采集急性期HFRS患者抗凝血样本共38份,恢复期病人血清29份。我们对采集的所有抗凝外周血样本进行分离血浆及PBMC处理,并将来自于同一HFRS患者的全血、血浆及外周血单个核细胞分别接种于预先培养好的Vero-E6细胞表面,并盲传三代,每代约21天,期间通过荧光定量PCR、双抗体夹心法ELISA、间接免疫荧光法等检测方法对盲传细胞上清进行抗原检测。经过三代盲传后,上述检测结果均显示有三份样本的汉坦病毒抗原确定为阳性,其中两份阳性样本来源于患者PBMC,而另一份阳性样本来源于患者血浆,且荧光定量PCR检测结果证实为汉滩型病毒。通过提取病毒RNA,并逆转录成cDNA,经PCR方法进行目的片段扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行全基因组测序。经测序,我们确定新获得三株汉滩型病毒毒株的全基因组序列,将上述三株病毒分别命名为SX26、SX27和SX30,测序结果显示分离株病毒的S、M、L基因片段大小分别约为1700bp、3580bp及6500bp左右。从GenBank网站下载汉坦病毒各型代表毒株,并通过BLAST比对下载同源性较高毒株构建系统发生树,使用生物信息学软件分析分离株病毒与其它汉坦病毒毒株的核苷酸及氨基酸同源性,发现新分离的三株病毒之间核苷酸与氨基酸相似性均较高,另外,S、M、L片段均与西安2010年鼠源分离株XAAa10091712同源性最近,在系统进化树上归属于同一分支。本次研究虽成功从HFRS患者血液样本中分离到汉坦病毒毒株,但毒株分离途径不同,分离自PBMC的SX26和SX27毒株未能从同一患者的全血或血浆样本中分离获得,而分离自血浆的SX30毒株也未能从PBMC中成功分离,我们推测原因可能是汉坦病毒分离难度较大,在病毒分离培养的过程中存在较多不可控因素,根据现阶段研究结果,尚无法确定PBMC方法与传统病毒分离方法相比,在病毒分离率上有明显优势,然而本研究证明了从PBMC中分离汉坦病毒的可行性,为进一步提高汉坦病毒分离率的研究奠定了基础。针对分离获得的汉坦病毒毒株,我们进一步对其进行血清学特性研究,采用微量中和试验方法,分析所收集的HFRS病人恢复期血清和疫苗免疫者血清各50份样本,针对不同汉坦病毒毒株的中和抗体滴度差别。研究确定病人恢复期血清样本全部为HTNV型,且对SX26毒株的中和抗体滴度稍高于疫苗株Z10和西安人源分离株84FLi,提示西安地区汉坦病毒流行株的抗原性已发生部分改变,且与疫苗株抗原性差别较大。而疫苗免疫者血清针对疫苗株的中和抗体阳性率较高,针对SX26和84FLi毒株的阳性率则较低,推测目前西安地区所用汉坦病毒疫苗免疫效果可能有所减弱,但还需进一步研究予以验证。综上所述,本研究成功从急性期HFRS病人血液样本中分离到三株汉滩型病毒株,其中两株来源于PBMC样本,另一株来源于血浆样本,并且全部获得全基因组序列,证明了PBMC方法分离病毒的可行性,为进一步提高汉坦病毒分离率的研究提供了依据。另外,我们选择实验中病毒分离株和其它代表毒株,分别与HFRS病人恢复期血清和疫苗免疫者血清进行微量中和试验,对病毒分离株血清学的特性进行分析,同时也为进一步评价疫苗免疫效果奠定了基础。