论文部分内容阅读
目的：通过TMT(Tandem mass tag)蛋白质组学技术，筛选冠心病伏寒证的差异蛋白，分析其生物学功能，探讨冠心病伏寒证的生物学机制，为“先天伏寒”证候标志物的确立提供依据，进一步研究“先天伏寒”这一理论的真实内涵，探讨其发病机制，为临床诊断及治疗提供依据，让中医实现更加精准化。分析冠心病子代中具有伏寒特征的两个不同节点人群的差异表达蛋白，其差异表达的蛋白是否与动脉硬化的形成有关联，探讨冠心病伏寒证的遗传特征，为临床早期干预疾病、筛选冠心病易感人群提供研究基础。
方法：以冠心病先天伏寒证与冠心病其它不同证候（选择与本证候有交集的冠心病常见四个证候-气虚血瘀证、心肾阳虚证、心肾阴虚证、气滞血瘀证）及健康人作为研究对象，利用TMT技术联合液相色谱、串联质谱(LC-MS/MS)技术，寻找具有特异表达的差异蛋白，结合生物信息学技术，分析差异蛋白的功能及参与的通路，结合PRM蛋白定量技术，对差异蛋白进行验证，确定差异蛋白的可靠性，证实这类人群易患冠心病的生物学机制。并将对冠心病伏寒证这一类人群进行纵向研究，以其子代中具有伏寒特征的人群作为研究对象，分别与不具备上述证候特征的人群及健康人群作对照，同样通过蛋白质组学分析，找到与动脉硬化形成相关联的生物物质，同时结合PRM蛋白定量技术对特异蛋白进行验证，确定实验结果。
结果：1.通过TMT技术筛选差异蛋白，发现先天伏寒证和健康人以及与其他四组证型共同的差异蛋白有5个，分别是免疫球蛋白变量4-69（ Immunoglobulin lambda variable4-69）、异戊烯半胱氨酸氧化酶（Prenylcysteine oxidase1）、果糖二磷酸醛缩酶A（Fructose-bisphosphate aldolase A）、补体C3（Complement C3）以及可溶性钙活化核苷酸酶（Soluble calcium-activated nucleotidase1）。
2.对差异蛋白进行生信分析发现，伏寒证与各组的差异蛋白功能主要是绑定、催化活性、信号传导以及转运活动等；差异表达蛋白质主要参与了细胞过程、生物调控、应激反应、代谢过程、免疫效应的进程、定位等重要生物学过程。伏寒证的差异蛋白参与的通路多与细胞信号传导或代谢有关。
3.经PRM验证，4个差异蛋白的趋势与TMT定量蛋白筛选结果一致。其中Fructose-bisphosphate aldolase、AImmunoglobulin lambda variable4-69、Prenylcysteine oxidase1在伏寒证表现为上调；Complement C3在伏寒证表现为下调。
4.冠心病子代伏寒证的差异蛋白经TMT技术筛选及PRM验证，最终5个差异蛋白趋势一致，分别是分别是Reticulon-4 receptor-like2、Desmocollin-1、Mannose-binding protein C、Serglycin、Monocyte differentiation antigen CD14。其中Desmocollin-1是伏寒14岁年龄段表达上调的差异蛋白；Serglycin是伏寒35岁年龄段表达上调的差异蛋白、Mannose-binding protein C是伏寒35岁年龄段表达下调的差异蛋白；Reticulon-4 receptor-like2、Monocyte differentiation antigen CD14两种蛋白在伏寒14岁及伏寒35岁均表现出上调。
5.经过生信分析发现，子代伏寒两个年龄节点的差异蛋白功能与冠心病伏寒证功能相似，均参与细胞加工(celluar process)、代谢过程(metabolic process)、生物调节（biological regulation）、生物过程的正负调控(regulation of biological process、positive regulation of biological process、negative regulation of biological process)等生物学功能；分子功能分析显示，主要有绑定(binding)、催化活性(cataytic activity)；细胞组分分析显示，主要有细胞(cell)、细胞区(cell part)、细胞器(organelle)、胞外区(extracellular region)、细胞膜(membrane)等；均参与了Cell adhesion molecules、Complement and coagulation cascades、PI3K-Akt signaling pathway这几条通路。
结论：冠心病伏寒证的遗传特征及生物学机制可能与Cell adhesion molecules、Complement and coagulation cascades、PI3K-Akt signaling pathway这几条通路相关。Fructose-bisphosphate aldolase A、Immunoglobulin lambda variable4-69、Prenylcysteine oxidase1、Complement C3可能是冠心病伏寒证的证候标志物。子代伏寒发现差异蛋白Mannose-binding protein C与Complement C3关系密切。进一步证实了冠心病伏寒证具有一定的遗传倾向，为临床早期干预疾病、筛选冠心病易感人群提供研究基础，为进一步研究及治疗伏寒证提供了思路及靶点。
方法：以冠心病先天伏寒证与冠心病其它不同证候（选择与本证候有交集的冠心病常见四个证候-气虚血瘀证、心肾阳虚证、心肾阴虚证、气滞血瘀证）及健康人作为研究对象，利用TMT技术联合液相色谱、串联质谱(LC-MS/MS)技术，寻找具有特异表达的差异蛋白，结合生物信息学技术，分析差异蛋白的功能及参与的通路，结合PRM蛋白定量技术，对差异蛋白进行验证，确定差异蛋白的可靠性，证实这类人群易患冠心病的生物学机制。并将对冠心病伏寒证这一类人群进行纵向研究，以其子代中具有伏寒特征的人群作为研究对象，分别与不具备上述证候特征的人群及健康人群作对照，同样通过蛋白质组学分析，找到与动脉硬化形成相关联的生物物质，同时结合PRM蛋白定量技术对特异蛋白进行验证，确定实验结果。
结果：1.通过TMT技术筛选差异蛋白，发现先天伏寒证和健康人以及与其他四组证型共同的差异蛋白有5个，分别是免疫球蛋白变量4-69（ Immunoglobulin lambda variable4-69）、异戊烯半胱氨酸氧化酶（Prenylcysteine oxidase1）、果糖二磷酸醛缩酶A（Fructose-bisphosphate aldolase A）、补体C3（Complement C3）以及可溶性钙活化核苷酸酶（Soluble calcium-activated nucleotidase1）。
2.对差异蛋白进行生信分析发现，伏寒证与各组的差异蛋白功能主要是绑定、催化活性、信号传导以及转运活动等；差异表达蛋白质主要参与了细胞过程、生物调控、应激反应、代谢过程、免疫效应的进程、定位等重要生物学过程。伏寒证的差异蛋白参与的通路多与细胞信号传导或代谢有关。
3.经PRM验证，4个差异蛋白的趋势与TMT定量蛋白筛选结果一致。其中Fructose-bisphosphate aldolase、AImmunoglobulin lambda variable4-69、Prenylcysteine oxidase1在伏寒证表现为上调；Complement C3在伏寒证表现为下调。
4.冠心病子代伏寒证的差异蛋白经TMT技术筛选及PRM验证，最终5个差异蛋白趋势一致，分别是分别是Reticulon-4 receptor-like2、Desmocollin-1、Mannose-binding protein C、Serglycin、Monocyte differentiation antigen CD14。其中Desmocollin-1是伏寒14岁年龄段表达上调的差异蛋白；Serglycin是伏寒35岁年龄段表达上调的差异蛋白、Mannose-binding protein C是伏寒35岁年龄段表达下调的差异蛋白；Reticulon-4 receptor-like2、Monocyte differentiation antigen CD14两种蛋白在伏寒14岁及伏寒35岁均表现出上调。
5.经过生信分析发现，子代伏寒两个年龄节点的差异蛋白功能与冠心病伏寒证功能相似，均参与细胞加工(celluar process)、代谢过程(metabolic process)、生物调节（biological regulation）、生物过程的正负调控(regulation of biological process、positive regulation of biological process、negative regulation of biological process)等生物学功能；分子功能分析显示，主要有绑定(binding)、催化活性(cataytic activity)；细胞组分分析显示，主要有细胞(cell)、细胞区(cell part)、细胞器(organelle)、胞外区(extracellular region)、细胞膜(membrane)等；均参与了Cell adhesion molecules、Complement and coagulation cascades、PI3K-Akt signaling pathway这几条通路。
结论：冠心病伏寒证的遗传特征及生物学机制可能与Cell adhesion molecules、Complement and coagulation cascades、PI3K-Akt signaling pathway这几条通路相关。Fructose-bisphosphate aldolase A、Immunoglobulin lambda variable4-69、Prenylcysteine oxidase1、Complement C3可能是冠心病伏寒证的证候标志物。子代伏寒发现差异蛋白Mannose-binding protein C与Complement C3关系密切。进一步证实了冠心病伏寒证具有一定的遗传倾向，为临床早期干预疾病、筛选冠心病易感人群提供研究基础，为进一步研究及治疗伏寒证提供了思路及靶点。