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环氧水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)可对映选择性催化外消旋环氧化物开环,形成相应的光学纯邻二醇和保留未反应的环氧化物,或区域选择性开环,将底物完全转化为手性邻二醇。手性邻二醇是一类药物的手性砌块,例如R型间氯苯基乙二醇(wCPED)可用于合成一种β3-肾上腺素受体激动剂。本实验室前期从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组扩增了一种新型EH的编码基因(pvehl),并在E.coli BL21(DE3)中表达。研究表明,PvEH1对间氯环氧苯乙烷(mCSO)催化特性不理想。本研究以PvEH1为对象,拟借助分子对接、定点突变等技术分析其底物结合口袋对催化特性的影响。通过定向改造PvEH1改善其催化特性并进行机制分析。最后,优化反应条件并规模制备(R)-mCPED。对PvEH1进行同源模拟,构建了其3D结构模型。分别以(R)-与(S)-mCSO为模式底物,通过分子对接,确认了 23个底物结合口袋上与mCSO发生相互作用的位点(除催化位点)。再结合PvEH1与多个高对映归一性EHs序列比对的结果和文献报道确认了16个位点的拟取代氨基酸,剩余7个位点分别以亮氨酸取代。分别构建了 23个单点突变体,其中酶活性显著提高的单点突变体包括PvEH1V1061、PvEH1M129L、PvEH1M160A、PvEH1M175I和PvEH1S178T等5个,其中最优为PvEH1M129L,酶活性是PvEH1的1.6倍;对映归一性显著提高的单点突变体包括PvEH1W102L、PvEH1L105I、PvEH1Y149L和PvEH1P84L等4个,对映归一性最高为PvEH1W102L(80.6%eep),是PvEH1 的 80.6倍。将9个提高PvEH1催化特性的位点分为两类:5个位点提高酶活性(106、129、160、175和178)和4个位点提高对映归一性(102、105、149和184),分别进行单点饱和突变以筛选各位点上的最优氨基酸。结果表明,5个提高酶活性的位点最优氨基酸分别为I、L、A、I和T,并构建5位点随机组合突变文库并筛选获得了酶活性最优突变体PvEH1Z4(包含V106I、M160A、M175I和S178T)酶活性为野生型的3.1倍。4个提高对映归一性的位点最优氨基酸分别为L、I、L和W。以PvEH1Z4为模板,构建4位点随机组合突变文库并筛选获得了最优突变体PvEH1Z4X4-59(包含V106I、M160A、M175I、S178T、L105I和P184W),与PvEH1相比,酶活性和对映归一性分别提高了 2.6倍和92.6 倍。测定了 PvEH1和其突变体区域选择性系数和对映体比率(enantiomeric ratio,E),并结合分子动力学模拟技术分析其提高机理。意外发现,W102L可大幅提高突变体的对映选择性,例如E.coli/pveh1W102L对mCSO的E值为30,不利于其对映归一性水解rac-mCSO。另外,E.coli/pvehlW102L对与mCSO相似的底物对氯环氧苯乙烷(pCSO)E值为89。这意味着E.coli/pvehlW102L可应用于动力学拆分rac-pCSO。这可能是由于102位被亮氨酸取代抑制了PvEH1W102L活性中心与(R)-pCSO结合,却未影响其结合(S)-pCSO,优先催化(S)-pCSO水解,进而提高了 PvEH1W102L对pCSO的对映选择性。另一方面,184位被色氨酸取代、105位被缬氨酸取代后的PvEH1Z4X4-59区域选择性系数αS和βr均大于96%。根据分子动力学模拟结果,PvEH1Z4X-59上W184的侧链基团与(S)-mCSO上氯基发生相互作用,使后者的Cα优先受到攻击而生成(R)-mCPED,同时与(R)-mCSO结合方式保持不变,赋予了PvEH1Z4X4-59对rac-mCSO的对映归一性。优化了 E coli/pvehlW102L动力学拆分rac-pCSO初始反应浓度和反应时间。E.coli/pvehlW102L催化150 mM rac-pCSO 4 h后,可同时获得高纯度的(R)-pCSO和(R)-pCPED,(R)-pCSO的产率为45.62%,ees为96.3%;(R)-pCPED 的产率为50.91%,eep为90.26%。另外,优化了E.coli/pvehlZ4X4-59对映归一性水解rac-mCSO 反应介质和rac-mCSO的浓度。在含5%吐温20的磷酸缓冲液中,水解2.7 g rac-mCSO制备了2.51g(R)-mCPED,eep为93.1%,时空产率为6.32g·h-1.L-1。