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1.EGFR突变合并MET异常激活的吉非替尼耐药的NSCLC细胞株的建立背景:具有表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）敏感突变的非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer,NSCLC）患者应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）的治疗效果显著,而在治疗期间难以避免发生耐药。间充质-上皮转化因子（Mesenchymal-epithelial transition factor,MET）的异常激活被证实是EGFR-TKIs耐药的重要原因之一。然而,现有的通路调控机制和下游分子事件仍不足以完全解释MET介导的耐药性与肿瘤恶性生物学行为。本部分研究旨在建立EGFR-TKIs获得性耐药细胞株,筛选有MET异常激活的NSCLC细胞株克隆,为进一步开展MET异常激活所致的EGFR-TKIs耐药的研究提供实验对象。方法:选择具有EGFR敏感突变（携带EGFR基因19外显子缺失突变）的NSCLC细胞株HCC827和PC-9为实验对象,通过体外浓度递增法诱导建立吉非替尼耐药的细胞株。进行Western blot检测筛选MET高表达且异常激活的耐药株克隆HCC827GR与PC-9GR。CCK8法检测HCC827GR和PC-9GR细胞对吉非替尼耐药指数的变化。镜下观察耐药细胞的形态学变化,对比分析耐药细胞与亲本细胞中上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关分子表达的差异;应用Transwell侵袭实验,检测耐药细胞较亲本细胞侵袭能力的变化。进行Western blot检测吉非替尼处理后耐药细胞与亲本细胞中EGFR、MET及下游相关信号通路的变化差异。对耐药细胞EGFR基因的第18号到21号外显子进行测序,进一步分析是否存在T790M突变;应用q PCR检测耐药细胞中MET基因的拷贝数变化。结果:相对于EGFR野生型的细胞,具有EGFR敏感突变的HCC827细胞与PC-9细胞显示出对较低浓度的吉非替尼治疗敏感。经浓度递增法建立吉非替尼耐药的HCC827GR细胞及PC-9GR细胞,耐药细胞较亲本细胞的吉非替尼半抑制浓度（Half-maximal inhibitory concentration,IC50）显著增加。在形态学上,两株耐药细胞株较亲本细胞表现为细胞呈现梭形,细胞间隙增大,EMT表型增加并显示高侵袭性。通过Western blot方法检测发现,吉非替尼处理后,亲本细胞中的EGFR、ERK与AKT信号活性显著抑制,MET的磷酸化水平也被轻度抑制,而在同样浓度的吉非替尼处理下,耐药细胞株中的EGFR磷酸化水平虽然被显著抑制,但MET及相关下游信号分子活性仍得以维持。进行EGFR 18-21外显子测序分析,结果显示,亲本的HCC827细胞及PC-9细胞中并不存在T790M突变,而两株耐药细胞株在维持原有EGFR突变的情况下,并未产生新的T790M突变。MET拷贝数检测结果显示,HCC827GR细胞与PC-9GR细胞中的MET拷贝数均较亲本细胞上升。结论:本部分研究成功获得了EGFR突变合并MET异常激活的吉非替尼耐药细胞株,两株耐药细胞较亲本细胞均出现EMT表型及侵袭能力的增加;其均在吉非替尼处理后,MET及下游信号通路仍显著活化。两株耐药细胞中均未发现EGFR T790M获得性突变,但出现了MET基因拷贝数不同程度的增加。2.NSCLC细胞中MET与VEGF/VEGFR2信号存在正反馈背景:MET的异常激活可赋予癌细胞增殖、存活和侵袭转移的能力。近十几年来,MET已经成为NSCLC中的热门治疗靶点。MET的信号转导涉及许多分子事件,随着MET在癌症治疗耐药性发展中的重要作用被逐渐揭示,MET和其他受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）之间的相互调控也被深入研究。以血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体（Vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs）为靶标的抗血管生成药物已被公认是一种较为有效的抗肿瘤治疗策略。MET信号与VEGF信号通路均与其他众多RTKs信号之间存在复杂的正负反馈调控。然而,在NSCLC中MET和VEGF/VEGFRs/NRPs信号通路之间的潜在相互作用及其对肿瘤生长的影响知之甚少。本部分研究旨在探讨NSCLC中MET和VEGF信号通路之间的串扰,以进一步探索联合抑制MET和VEGF信号在EGFR突变合并MET异常激活的NSCLC中对于提高EGFR-TKIs治疗敏感性的潜在价值。方法:q PCR对比分析亲本细胞与MET异常激活的吉非替尼耐药细胞中的VEGF信号相关受体与共受体的表达。Western blot检测克唑替尼、MET sh RNA介导的MET信号抑制,或MET过表达质粒、慢病毒介导的MET过表达与活化对VEGFR2的表达与活性的影响。生信分析、双荧光素酶报告基因实验进一步明确MET对VEGFR2的转录调控作用。外源性VEGF刺激NSCLC细胞,Western blot检测VEGF信号对MET表达及活性的影响。免疫荧光、免疫共沉淀等实验方法揭示VEGF信号反向调控MET信号的具体机制。结果:MET异常活化的吉非替尼耐药细胞株中VEGFR2的表达及磷酸化活性显著增强。使用克唑替尼或MET sh RNA抑制MET信号活性可降低吉非替尼耐药细胞株中VEGFR2的表达与活性。在对MET低表达的NSCLC细胞株进行MET过表达可促进VEGFR2的表达与活化。分别对MET激活的经典下游信号MEK/ERK、PI3K/AKT与JAK/STAT3进行抑制发现,MET依赖于MEK/ERK信号通路促进VEGFR2表达与激活。进一步发现MET通过ERK信号促进ETS-1的表达,并通过ETS-1促进VEGFR2的转录。反过来,VEGF可显著诱导NSCLC细胞株中的MET及下游信号的激活,且在MET高表达的细胞中激活效应更显著。对VEGFR2进行抑制,可削弱VEGF对MET信号的激活作用。免疫共沉淀结果显示MET与VEGFR2在NSCLC细胞中存在相互作用,VEGF刺激可促进VEGFR2与MET的相互作用,并促进MET磷酸化。结论:MET以MEK/ERK依赖的方式上调VEGFR2的表达,并通过ETS-1促进VEGFR2转录。而VEGF促进VEGFR2与MET的相互作用,进一步促进MET磷酸化。结果提示,NSCLC细胞中MET与VEGF/VEGFR2信号通路形成正反馈环路,导致下游信号的持续激活。3.联合抑制MET和VEGF增强EGFR突变伴MET异常激活的耐药NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性背景:上述研究显示MET与VEGF/VEGFR2信号通路之间存在着正反馈。MET异常激活可以进一步促进VEGF/VEGFR2信号通路及下游信号的激活,VEGF/VEGFR2信号通路同样存在对MET信号及下游信号的促进作用。本研究旨在确定联合抑制MET和VEGF/VEGFR2信号通路在EGFR突变合并MET异常激活的耐药NSCLC中对EGFR-TKIs治疗敏感性的影响。方法:本部分研究使用了三种临床批准的药物,吉非替尼（EGFR抑制剂）、克唑替尼（间变性淋巴瘤激酶和MET抑制剂）和贝伐珠单抗（抗VEGF抗体）的不同组合方式处理HCC827GR细胞,检测其分别对细胞活力及EGFR、MET、ERK信号和凋亡蛋白PARP活性的影响。在体内,应用异种移植瘤模型,检测不同药物组合对肿瘤的抑制作用,分析不同药物组合对肿瘤血管生成的影响。回顾性分析一例EGFR突变合并MET扩增患者的临床病理资料及诊疗经过,总结EGFR突变合并MET扩增患者的临床特征与潜在可行治疗策略。结果:与任何单药或双药治疗相比,吉非替尼、克唑替尼和贝伐珠单抗的三联疗法对细胞生长的抑制更显著,且这种三重抑制导致EGFR信号、MET信号及ERK活性被显著抑制,切割的PARP表达显著上调。体内研究显示,吉非替尼单药对耐药细胞移植瘤的生长抑制作用有限,在联合MET抑制剂克唑替尼的情况下,肿瘤生长可被显著抑制。最重要的是,MET和VEGF的双重抑制显著增加了吉非替尼在耐药细胞移植瘤中的抗肿瘤作用。与肿瘤体积数据相一致,三药联合治疗组的肿瘤组织样本中Ki-67蛋白表达水平最低;TUNEL检测的凋亡水平增加最显著;三药联合组肿瘤组织的血管化程度也最低。此外,在本中心的一名EGFR突变合并MET扩增的肺腺癌患者的治疗中,也确定了这种三药联合治疗对逆转MET异常所致的EGFR-TKIs耐药的可行性。结论:联合抑制MET和VEGF/VEGFR2信号通路有助于增强EGFR-TKIs治疗敏感性,这种抗EGFR、MET和VEGF的三药联合方案可显著抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成。