创伤和各种疾病引起的喉、气管软骨缺损对患者生活质量影响很大，严重威胁着病人生命。因此，多年来，耳鼻咽喉科医师致力于探索和完善符合喉、气管解剖和功能特点要求的修复和重建方法。曾有自体或同种异体软骨及人工替代材料应用于临床，但在解剖结构、供区缺损、免疫排斥及难以与机体融合等方面存在不足。组织工程技术的发展有可能避免传统治疗方法的缺陷，解决喉、气管修复与重建这一难题。组织工程技术的开展需要大量的种子细胞和良好的细胞支架材料，才能满足工程化组织或器官的生成和塑形要求。种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。由于组织工程多需要高浓度的细胞接种，自体组织细胞存在着数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。于是，本课题从干细胞工程出发进行研究。 第四军医大学99以协士学位论文 干细胞工程是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对间充质干细 胞、胚胎干细胞、血管／造血干细胞、神经于细胞和皮肤、肌肉等前体细胞 进行体外分离纯化、定向诱导分化、转基因及核移植、大量扩增和整合构 建，在体外重建人骨、软骨、肌肉、肌赃、瓣膜、脂肪、真皮、基质、神 经、血管、皮肤、角膜以及造血和免疫等组织，其中骨髓基质干细胞是一 研究热点。骨髓基质干细胞（mesench帅al stem cells，MSCs）是指那些具 有自我复制能力，并且可以经过不可逆的终末分化过程产生于代细胞的细 胞，它可以通过各种于代细胞、前体细胞的分化谱系产生多种细胞表现型 的表达。成年人骨髓中存在一定数目的MSCS，能够通过分化形成多种中 胚层组织，包括骨和软骨组织、肌鲢、肌肉、脂肪组织以及骨髓基质结缔． 组织。为寻求良好的种子细胞，我们采用组织工程方法进行了上述实验， 将人骨髓MSCs在体外分离、培养后结果表明：人骨髓MSCs在体外经无 血清培养基培养可以诱导为软骨细胞，本实验就是利用这一特性，拟对人 骨髓MSCS进行培养及诱导后，构建组织工程化软骨组织，用于耳鼻咽喉 科领域内的软骨修复与功能重建，为喉、气管软骨缺损的修复提供新途径。 材料与方法 1．人骨髓间质干细胞的体外分离和培养 剪开从我院胸外科手术中所获得的肋骨骨髓腔，用含双抗的不完全培 养基反复冲洗骨髓腔得到骨髓液，经密度梯度离心获得单个核细胞，体外 培养、分离获得人骨髓MSCS，加入含10％小牛血清的L－DMEM（含青霉 素钠 100U／Inl，链霉素 100 u g／ml），置入 5OCOz孵箱内 3尹C培养，观察 原代细胞的生物学特性，并绘制生长曲线。 2．流式细胞仪检测细胞表面标志物 一二一 可口军区大学99扭俗士学位论X 收集生长良好的传代培养的人骨髓 MSCS，浓度约为 SX 10勺ml，pBS 洗涤后，送流式细胞仪检测细胞表面标志物一CD29、CD44、CDI4、CD34 及CD45。 3．人骨髓间质干细胞的传代培养和诱导 将传代的人骨髓 MSCS悬液以 IX 10‘／ml接种于预先置入盖玻片的 6 孔培养扳，直径3．scm，各孔加入ZmlH－DMEM完全培养液，次R换为 ZmIH－DMEM无血清诱导培养液，其中含转化生长因子－日；10ng／ml、地塞 米松 100nMol／L、维生素 C50u g／ml、胰岛素 10U／ml、甲状腺素 50ng／ml． 6－甘油磷酸钠20mMol／L和牛血清白蛋白125mg／ml；对照孔内只加入Zml 完全 H－DMEM培养液培养，隔日换液一次。分别在诱导后第 7、14、ZIQ 天，取出盖玻片，进行相应检测－倒置显微镜下观察细胞形态、电镜观察细 胞外基质、l％甲苯胺蓝染色、免疫组化染色。 4．诱导后人骨髓间质干细胞在棵鼠体内形成工程化软骨 将诱导后的人骨髓 MSCs悬液按浓度为 2 XI 06／ml接种于预先处理好 的 5块材料上，置入 5％CO。孵箱内 370C 4小时后，加入培养基继续体外 培养7天。3块材料上不加细胞，作为对照组。将细胞－村料复合物和对照 组材料分别埋植于7只裸鼠的背部皮下，于6周后取材，实验组和对照组 分别取一块送电镜观察，余下的进行HE病理切片观察。 结 果 1．细胞培养 在原代培养的人骨髓MSCS中，多数为成纤维样的梭形细胞，偶有宽 阔、?