鞘糖脂是由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子,作为人体内重要的生物活性物质,它们参与了多种生理和病理过程,如信号传导、免疫、癌症发生和胰岛素抗性等。研究发现,鞘糖脂类具有作为疾病药物、治疗靶标及潜在诊断标记的潜力,因此对该类化合物制备及药用研究受到学术界的广泛关注。目前鞘糖脂类药物的大量制备主要依赖从动物脑组织中提取,存在成本较高、来源有限,且有受疯牛病等人畜共患病污染的潜在危险。通过工程化的系统设计,构建鞘糖脂类体外生物合成体系,探索相关酶催化及底物选择性机制,不仅将深度揭示酶结构-功能关系,还将有助于实现鞘糖脂的高效、廉价合成。在本实验室的前期工作中,已成功创建了鞘糖脂的体外多酶合成体系;为进一步提高人工体系的运行效率,我们对多酶体系中的三类关键酶:鞘糖脂内切糖苷酶、鞘糖脂N-去酰基化酶、及岩藻糖基转移酶在酶学功能表征、结构机制解析、酶分子改造等方面进行了系统研究。天然的鞘糖脂内切糖苷酶（EGCase）催化鞘糖脂糖苷键的水解。但通过对其活性中心的亲核攻击残基进行突变,可将EGCase改造为糖苷合成酶,从而催化氟代糖链模块和鞘氨醇模块缩合生成溶血鞘糖脂。我们通过数据库搜索与活性测定,从Rhodococcus equi 103S基因组中鉴定了一个新的EGCase基因（EGCase I）,其催化效率(k_cat/K_m)比目前广泛使用的Rhodococcus sp.M-777鞘糖脂内切酶EGCase II高130倍,且具有更广泛的底物选择性。为深入解析EGCase的作用机制,我们首次解析了EGCase I的晶体结构及其与GM1底物结合的复合体结构,阐明了该酶具有高催化活性和宽底物特异性的结构基础。通过与EGCase II的结构进行比较,鉴定了影响EGCase II活力的关键氨基酸,并在此基础上通过理性设计获得了活力提高10倍、且底物谱更宽的EGCase II突变酶,为构建获得高效的糖苷合成酶奠定了基础。鞘糖脂N-去酰基化酶（SCDase）能够催化鞘糖脂中酰胺键水解或合成,是典型的双功能酶。SCDase在鞘糖脂人工合成体系中催化溶血鞘糖脂和脂肪酸链的缩合,生成完整的鞘糖脂结构,是主要的限速步骤之一。为获得更高效的SCDase催化元件,我们克隆并系统表征了来源于海洋微生物Shewanella alga G8的鞘糖脂N-去酰基化酶（SA_SCD）。SA_SCD与来自于Pseudomonas sp.TK4的商品化PS_SCD相比,水解活性高9倍,合成活性高38倍,而且可以更有效利用不饱和脂肪酸、极短和极长链脂肪酸合成鞘糖脂。SA_SCD的优良酶学特性以及能够在大肠杆菌中异源表达的能力,使它在鞘糖脂高效生物合成及结构衍生中具有良好的应用潜力。岩藻糖基转移酶（FucT）可用来催化合成一系列含有岩藻糖基的鞘糖脂。由于此类鞘糖脂与多种癌症发生和发展密切相关,因此受到学术界的广泛关注。为了提高岩藻糖基转移酶的催化效率,我们首先使用来源于幽门螺杆菌H.pylori NCTC11639的α1,3-岩藻糖基转移酶（FutA）作为模式酶,建立了适用于岩藻糖基转移酶的FACS超高通量筛选方法,筛选速度达到每小时10⁷以上。在模式筛选实验中,表达了FutA的大肠杆菌从大量无酶活性细胞中富集的倍数高达10⁴倍,而且可以对表达酶活力相差2倍的菌株进行有效区分,证明了该方法的有效性。随后我们对库容量高达4×10⁶的FutA随机突变库进行3轮筛选获得了催化活力明显提高的突变体A4（Y199N/V368A/D407N）和D9（E340D）。在此基础上,我们又设计了针对α1,2-岩藻糖基转移酶的荧光受体底物,拓展了该技术的应用空间,为岩藻糖基转移酶的大范围改造奠定了基础。综上所述,本论文围绕鞘糖脂类人工合成体系的关键酶系进行了系统的研究,发现了性质优良的EGCase和SCDase新酶源,解析了EGCase的底物选择性机制,开发了岩藻糖基转移酶的高通量筛选方法,并通过分子改造获得多种性质更优良的突变酶。本论文工作将有助于进一步对鞘糖脂合成酶系进行系统的人工设计和优化,最终为实现重要鞘糖脂类药物的高效合成和结构创新提供技术源头和理论支撑。