蜂王浆(royal jelly)是蜜蜂工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体(俗称王浆腺)分泌蜂王浆的乳状物质,是1-3龄工蜂幼虫及蜂王的终生食料,它含有丰富的生物活性成分,多种生理活性和营养保健功能。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是原产于我国的土著具蜂种,具有明显优于西方蜜蜂(Apis mellifera)的抗病性。近期研究表明,中华蜜蜂抗病性优于西方蜜蜂以及蜂王浆不易变质的特性都与抗菌肽royalisin有关。此前,本实验室已完成了对中华蜜蜂抗菌肽Acc-Royalisin的原核表达及表达产物抑菌活性初步研究。本研究重点进行了原核表达放大试验,产物规模化分离纯化。在此基础上,进行了原核表达产物抑菌谱、代表菌最低抑菌浓度、抑菌稳定性、抑菌机理的系统研究。同时,进行了Acc-Royalisin基因真核表达载体构建。首先,以含Acc-Royalisin基因的载体为模板,采用引入编码6×His+EK DNA序列的5-P引物,和编码Acc-Royalisin基因的3-P引物,进行目的基因PCR扩增。然后将引入6×His+EK DNA序列的目的基因连结到pGEX-4T-2载体的GST基因3’端。最后,以此插入GST-6×His-EK-AccRoyalisin序列的载体pGEX-4T-2-AccRoyalisin为模板,采用根据此重组序列和酵母表达载体pPIC9K的相应酶切位点Snab I和NotⅠ设计的5-P和3-P引物,进行目的基因PCR扩增,得到长度约850 bp的DNA片段。将纯化的PCR产物和酵母表达载体pPIC9K分别用Snab I和Not I双酶切,酶切产物再分别作电泳检测和割胶回收,连接,转化DH5α感受态细胞,培养筛选出重组AccRoyalisin-pPIC9K阳性克隆。将AccRoyalisin-pPIC9K线性化,电击转化毕彻酵母GS115。抽提酵母基因组DNA,进行PCR鉴定,筛选出含目的基因的重组子。对重组酵母行诱导表达,表达产物SDS-PAGE电泳分析。结果表明,表达产物在30 kDa处具有特异性条带。以GST多克隆抗体为一抗进一步作Western blot检测,结果检测到目的蛋白印迹,说明AccRoyalisin基因在酵母菌中也已表达成功。所表达的多肽经纯化获得单一蛋白。抑菌活性检测结果表明,重组酵母表达的AccRoyalisin对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和黄色微球菌具有抑制活性。