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胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）可引起猪传染性胸膜肺炎,是严重危害养猪业的病原菌之一。APP主要侵袭猪的扁桃体和上呼吸道,并在肺部定植和繁殖,表现为急性感染死亡和慢性感染,以出血性、纤维素性、坏死性胸膜炎和肺炎为主要特征。细胞因子是宿主抗感染应答的重要产物,在诱导免疫应答和平衡体内稳态中起着重要作用。肺脏与外界相通,免疫应答活跃,且具有明显的病原特征性,但目前APP感染诱导的细胞因子应答特征及其在疾病发生发展中的作用尚缺乏全面、深入的研究,因此,本课题以仔猪和小鼠为感染动物对APP感染诱导的肺脏免疫应答特征和主要细胞因子的功能开展研究,为揭示细胞因子在肺炎中的作用、机制和在抗感染中的应用奠定基础。主要研究如下:1、明确猪胸膜肺炎肺脏免疫应答特征及其与小鼠APP感染模型的比较本研究首先建立了仔猪APP肺脏感染模型,收集感染后不同时间点仔猪的肺组织进行转录组测序分析和免疫组化染色、并对肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和血清中29种细胞因子进行ELISA检测。结果显示,BALF和外周血中细胞因子应答存在明显差异,血清细胞因子应答早于肺脏,肺脏在感染早期以免疫抑制为主,后期形成局部过度炎症。为深入挖掘APP的免疫应答特征,我们建立了小鼠APP感染模型,通过单细胞质谱流式技术解析小鼠肺组织、脾脏和外周血的免疫细胞应答特征,ELISA检测细胞因子变化。发现肺组织、脾脏和外周血的免疫细胞具有较强的组织特异性,并鉴定了多种感染组织特异性的细胞亚群。与仔猪相比,小鼠的细胞因子变化特征虽不完全一致,但整体变化趋势相同。因此,结合文献报道及本研究中APP感染病程和肺脏损伤程度,筛选出仔猪感染早期（6 h）血清和BALF中含量均显著升高的IL-1β和IL-18,中后期（24-48 h）仅在BALF中升高的IL-21作为后期研究的主要细胞因子。2、解析APP感染诱导肺脏产生的细胞因子间相互关系为了解APP感染过程中肺脏细胞因子产生过程中的级联关系,成功制备健康仔猪精密活体肺切片（Precision-cut lung slices,PCLS）,以APP感染PCLS,研究了仔猪感染APP后发生显著升高的7种主要细胞因子之间的相互关系。同时建立IFN-γ、IL-5、IL-21和IL-6缺失小鼠的APP感染模型,用Luminex液相芯片对参与免疫应答的31种细胞因子进行感染后的动态检测。结果发现APP感染后细胞因子间存在级联触发关系,IL-18与IL-21组合可以促进IL-17A、GM-CSF、IFN-γ和IL-21的表达。在基因缺失鼠的APP感染模型中,IL-21缺失,导致感染后GM-CSF、IL-18和IL-12等促炎因子大量上调,抑炎因子IL-10下调,加重肺损伤;IFN-γ缺失,感染早期（6 h）即可使TNF-α、IL-6、IL-4、IL-17A和IL-18快速上调后再下降,后期则显著抑制炎症因子,促进小鼠肺炎恢复。3、揭示NLRP3以非炎性体依赖的方式介导APP诱导巨噬细胞死亡,促进感染APP感染仔猪后BALF和血清中IL-1β和IL-18均显著升高,为了解NLRP3在APP感染中的作用,本研究中利用APP感染WT、NLRP3-/-、ASC-/-和caspase1/11-/-小鼠发现NLRP3缺乏并没有通过抑制IL-1β和IL-18分泌以显著提高APP感染防御能力。流式细胞术检测APP感染6、12和24 h肺脏中淋巴细胞和髓系细胞比例发现,NLRP3显著降低NK、NKT和CD4+T细胞在肺脏中的基础水平,同时显著降低感染后NK和NKT细胞的比例,抑制肺脏清菌。除此之外,NLRP3并不影响肺脏中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞的比例,但却促进巨噬细胞的死亡。最后对APP感染WT和NLRP3-/-小鼠骨髓来源巨噬细胞转录组测序分析发现,NLRP3促进APP感染后巨噬细胞死亡、细胞因子CXCL5和IL-1β的表达,并使巨噬细胞偏向M2型极化。4、阐明IL-21/IL-21R信号通路抗APP感染的作用及机制IL-21/IL-21R信号通路在多种免疫疾病和细胞发育中发挥重要作用,但关于IL-21/IL-21R在细菌性肺炎肺免疫应答中的调节作用尚无系统研究。本实验建立IL-21R-/-小鼠APP感染模型,联合应用质谱流式细胞术和传统流式细胞术,检测IL-21/IL-21R信号通路对APP感染后肺组织免疫细胞组成和功能的影响,并阐明关键免疫细胞亚群在APP肺脏免疫应答中的作用和机制。结果显示,IL-21R-/-小鼠比WT小鼠更易感染APP。IL-21R-/-显著降低小鼠肺组织促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-6）的表达,同时抑制中性粒细胞的活化,炎症单核细胞的招募,减少M1巨噬细胞的数量,削弱肺脏天然免疫应答。与IL-21R-/-小鼠相比,在APP感染后的WT小鼠肺组织发现了一种之前尚未被报道的Ly6C和Ly6G双阳性CD4+T细胞亚群,该亚群具有较强的IL-10、IL-21、颗粒酶B和穿孔素的分泌能力,并能直接促进巨噬细胞增殖和吞噬杀菌功能。这些结果表明,IL-21诱导的Ly6C+Ly6G+CD4+T细胞与巨噬细胞协同对抗APP感染。综上,本研究明确了胸膜肺炎放线杆菌感染仔猪过程中肺脏细胞因子的动态表达特征和主要细胞因子间级联关系,并揭示了NLRP3和IL-21在APP感染中作用和机制。丰富了细菌性肺炎的免疫应答相关理论,为猪传染性胸膜肺炎等疾病的防治提供了有益参考。