目的:　　本文以高通量测序以及基因组信息分析手段，研究不同年份临床分离的211株铜绿假单胞菌(PA)携带的氨基糖苷类、β-内酰胺类耐药基因，并通过克隆表达以及药敏实验验证其功能，阐明了铜绿假单胞菌耐药性形成的分子机制。另外，通过与数据库耐药性基因相关同源序列比较分析，发现本文若干耐药性基因两侧可能存在可移动DNA元件，并通过PCR产物测序验证可移动DNA元件的存在，通过对耐药基因相关可移动DNA元件的结构分析，为进一步研究病原菌耐药性基因的水平转移导致耐药性播散提供实验依据。　　方法:　　1、实验菌株:本文以温州医科大学附属第一医院临床2011-2013年分离得到的211株PA菌株为研究对象，提取其混合基因组并进行solexa测序。　　2、耐药性基因参考序列的收集:收集GenBank、耐药基因数据库耐药性相关基因序列，整理并去冗余，最后得到具有已知功能的151条氨基糖苷类耐药基因序列和81条β-内酰胺类耐药基因序列。　　3、混合基因组测序耐药性基因的筛选:通过一些生物信息工具(Blast、Perl、Clustalw、Samtools、GATK、Bwa、SOAP denovo、MEGA)以上述两类耐药性基因为参考序列进行PA混合基因组测序读长mapping，分析这些耐药基因在PA中的分布情况以及丰度差异。根据mapping结果选出一些覆盖度高于0.9，丰度相对低的基因，且鲜有报道的基因作为靶基因进行研究。　　4、靶基因的克隆和功能测定:设计靶基因引物，以单个菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，筛选靶基因阳性PA菌株。对PCR扩增产物进行TA克隆并转化到大肠杆菌JM109，提取重组质粒并通过双酶切，最后将靶基因连接入表达载体，再转化到工程菌大肠杆菌BL21，在Amp板上筛选出阳性克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆菌株。然后通过药敏实验来测定这些阳性克隆株对22种药物的MIC值，通过与阴性对照菌的MIC值比较来判断其耐药功能。　　5、耐药基因相关可移动DNA元件分析:首先用SOAP denove软件对PA混合基因组短reads进行拼接，获得一些Contigs和scaffolds，对序列进行注释并定位靶基因所在的序列片段，分析靶基因两侧序列中可能存在的可移动DNA元件结构，或以靶基因所在序列片段为咨询序列，搜索核酸序列数据库，提取数据库相似序列及其两侧序列，分析靶基因两侧可能存在的可移动DNA元件;根据分析结果，设计靶基因相关的可移动DNA元件序列片段的引物，通过PCR产物测序，验证靶基因相关可移动DNA元件在铜绿假单胞菌中的存在。　　结果:　　1.铜绿假单胞菌混合基因组高通量测序结果产生的短序列reads总数有70，239，195条，reads的长度均为100nt。将reads mapping到151条氨基糖苷类耐药基因序列和81条β-内酰胺类耐药基因序列上，最后发现有25个氨基糖苷类耐药基因型和3个β-内酰胺类耐药基因存在于铜绿假单胞菌中。其中氨基糖苷类耐药基因丰度最高的基因型为aph(3）-Ⅱb，丰度有1636.218X，覆盖度0.9988;丰度最低的基因型是aadA12，丰度有2.2X，覆盖度80.1％。β-内酰胺类耐药基因丰度最高的基因型为blaGES,丰度有198.75X，覆盖度1;丰度最低的基因型是blaTEM,丰度有4.24X，覆盖度0.9605。　　2.从211株铜绿假单胞菌中，PCR筛选出四株菌。TL1256、TL1257携带aph(3)-XV基因型，而两菌株TL1280、TL1299含有blaGES基因型。　　3.PCR产物测序结果分析，TL1256与TL1257中的aph(3）-XV基因型与参照序列(Y18050)的identity为100％，TL1280与TL1299的blaGES基因与参照序列(HM240862)的identity也为100％。　　4.对aph(3）-XV基因进行进化树分析，发现本文分离的aph(3)-XV耐药性基因与变形菌（WP_019407932.1）、铜绿假单胞菌（WP_033945914.1、WP_034067921.1、WP_034085231.1）、不动杆菌(WP_032492579.1)等基因编码蛋白的亲缘关系很近，因此可以推出aph(3)-XV基因在铜绿假单胞菌、变形菌以及不动杆菌之间发生了水平转移。　　5.成功将aph(3)-XV基因连接到pET-15b表达载体，并成功构建能表达目的基因的重组菌pET∷aph(3)-XV/BL21。将blaGES基因连接到pET-28a表达载体，并成功构建能表达目的基因的重组菌pET∷blaGES/BL21。　　6.MIC功能验证，TL1280、TL1299中发现的blaGES基因对头孢唑林、氨苄西林、哌拉西林、哌拉他唑、新霉素、卡那霉素的MIC值比对照组高出5个浓度梯度以上，对头孢西丁高出3个梯度，对亚胺培南高出2个梯度。TL1256、TL1257中发现的aph(3)-XV基因对卡那霉素的MIC值比对照组高出4个浓度梯度左右，对新霉素只高出2个梯度左右。　　7.医院分离的211株铜绿假单胞菌随机挑选39株进行药敏实验，对其MIC值结果分析可知临床PA对β-内酰胺类抗生素存在着广泛的耐药性，而对氨基糖苷类特别是庆大、西索米星、小诺米星、奈替米星这些抗生素较为敏感。其中TL1256、TL1257这两株菌几乎对所有的药物都耐药，MIC值均达到了256μ g/mL以上;TL1280、TL1299这两株对大部分的β-内酰胺类抗生素耐药，MIC值达到了256μ g/mL以上。　　8.数据库数据分析显示aph(3)-XV基因可以位于Ⅰ类整合子中，本文对aph(3)-XV基因阳性菌TL1256与TL1257进行aph(3)-XV基因相关的Ⅰ类整合子PCR扩增，对PCR产物测序验证发现，该两菌的aph(3)-XV基因都存在于这个Ⅰ类整合子中，此外，我们同事发现bl aGES-1，aacA4也存在于Ⅰ类整合子中，由此可见，aph(3)-XV等耐药性基因基因可以通过Ⅰ类整合子来进行菌种间的水平转移的。　　结论:　　1.高通量测序技术和生物信息工具的结合，能使我们在短时间内测定上百株细菌的基因组序列，探索基因组序列结构与病原微生物的耐药性的关系，对于致病菌中耐药基因的分布及新基因的发掘和功能研究起着极为有效的作用。　　2.温州医科大学附属第一医院分离的铜绿假单胞菌中含有丰富的氨基糖苷类耐药基因和少量β-内酰胺类耐药基因，特别是发现了许多稀有的耐药性基因，如aadA12、 aadA4、 blaCARB、blaGES。　　3.本文铜绿假单胞菌TL1256、TL1257中发现的aph(3)-XV基因与文献报道的相似，对卡那霉素和新霉素的耐药，但是对文献报道过的对链霉素和阿米卡星的耐药性却不明显。　　4.TL1256、TL1257中发现的aph(3)-XV基因位于Ⅰ类整合子上，且Ⅰ类整合子上还有blaGES-1，aacA4这两个基因，显示了病原菌耐药性水平转移引起耐药性播散的复杂性。