研究背景食管癌（ICD-10:C15）是我国高发的癌症之一。根据国际癌症研究署2011年世界癌症发病与死亡报告（Globocan 2011）,全球食管癌发病48.16万例中,中国有25.92万例,占53.82%,而在同期40.65万死亡例中,中国占21.11万例,为51.92%。目前食管癌的主要治疗手段有外科手术治疗,辅以放疗,化疗和中医保守治疗。但病人总5年生存率不足10%%。食管癌预后不良的主要原因包括肿瘤细胞对放化疗药物的易耐药性。目前肿瘤微环境研究表明,肿瘤细胞在生长过程中持续经历着缺血、缺氧及营养物质缺乏等应激因素,致肿瘤细胞对外界恶劣环境有更强的适应能力。这种特性使得放、化疗治疗效果常不明显,甚至于对患者本身的伤害更大。角化珠系鳞状细胞癌癌巢中央的典型结构。在发生在皮肤、唇、口腔、食管、喉、子宫颈、阴道、阴茎等处原有鳞状上皮覆盖部位的肿瘤中较常见。镜下,分化好的鳞状细胞癌癌巢中间为层状角化物,即癌珠,周围相当于棘细胞层,外层相当于基底细胞。尽管有研究表明氧化应激在癌巢中心的细胞死亡进程发挥重要作用,但角化珠的形成原因仍不明了。热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）,是机体在应激（病毒、感染、缺氧、紫外线照射等）状态下,合成的一组高度保守的蛋白质分子,是体内重要的分子伴侣蛋白。HSP的研究已经成为现今生命科学领域研究的热点。近年来研究发现Hsp90（heat shock protein 90）作为HSP家族中重要的成员,在恶性肿瘤细胞中高表达,大量存在于细胞质中,参与包括信号转导、蛋白的折叠和降解等多种细胞进程。Hsp90还参与某些疾病的发生及发展机制,并且与癌基因及抑癌基因有密切关系,是多种癌基因通路中的重要组成部分;而它通过何种信号转导途径,有何种调节因子参与其中等等诸多细节问题,至今都未有报道能阐述清楚。Cyclin B1是控制细胞进入G2/M期的关键因子,活化并与CDKs即CDK1（cell division cycle）形成复合物,促使细胞进行G2/M期转变。细胞周期调控机制的破坏会导致细胞失控性生长和肿瘤的发生。近年来的研究表明,Cyclin B1在许多肿瘤中有过表达或定位改变等异常表达,呈现出癌基因的特性,其在肿瘤发生发展、预后、诊断、治疗过程中的作用受到广泛关注。如用抗肿瘤药物adriamycin处理人肺癌细胞株A549后,CyclinB1表达受抑制,导致G2期阻滞[1]。这提示CyclinB1表达抑制可能是某些抗肿瘤药物的作用机制之一。CyclinB1作为Hsp90的底物蛋白,同时又是调节细胞周期的关键的G2/M期调控因子,因此它可被作为与细胞周期调控密切相关的效应指标,用以阐明H₂O₂引起的氧化应激时与胞内Hsp90α关系。过氧化氢（H₂O₂）可透过细胞膜,能在细胞间和细胞内自由扩散,同时也是细胞内最丰富的活性氧簇ROS（reactive oxygen species,ROS）之一,参与调节新陈代谢、老年性疾病、凋亡和生长因子相关的信号通路。尽管其本身会迅速与信号分子反应而失活,但其造成级联反应能导致氧化应激持续存在,使其成为氧化应激研究的重要工具药。本课题组前期实验结果表明HepG2细胞经过氧化氢处理后Hsp90α和Cyclin B1的表达会有一个反向的关系,那么Hsp90α和Cyclin B1在食管鳞癌中是否存在相关关系?这是本课题研究的主要内容。基于以上分析,本课题主要从定量和半定量角度,结合Hsp90α和Cyclin B1在食管鳞癌中的定位情况揭示其表达特点及变化规律,分析其在食管鳞癌中的预后意义。此外,我们用过氧化氢处理食管癌高分化细胞TE-1,分析Hsp90α和CyclinB1的表达情况,及对细胞周期的影响,进一步揭示氧化应激在食管癌角化珠形成机制,为其治疗提供新思路。目的:1.分析Hsp90α和Cyclin B1食管鳞癌中表达特点及变化规律,并分析其表达与食管鳞癌病理特征的关系及在食管鳞癌预后中的意义;2.结合Hsp90α和Cyclin B1在食管鳞癌组织及角化珠的表达情况,分析两者关系,初步探讨肿瘤微环境对Hsp90α和CyclinB1的影响及角化珠形成机制;3.确定过氧化氢对TE-1细胞增殖及细胞周期是否存在影响;4.观察过氧化氢处理的TE-1胞内Hsp90α、cyclinB1总蛋白表达情况;5.在组织分析结果及食管鳞癌细胞TE-1用过氧化氢建立的氧化应激模型上,探讨氧化应激诱导的细胞周期阻滞的分子机制及Hsp90α参与调节的作用机制,初步揭示食管鳞癌角化珠形成的可能机制。材料和方法:免疫组化用免疫组织化学SP方法检测81例Hsp90α蛋白和65例Cyclin B1蛋白在蛋白食管鳞癌的表达,采用半定量分析判断。光镜下每张切片随机选取高倍视野在食管癌组织中细胞,计数500个细胞,以出现棕黄色颗粒作为阳性细胞,根据阳性细胞数不同可以分为以下5个等级:<5%为0分;5%-25%为1分;25%-50%为2分;50%-75%为3分;75%-100%为4分。依据染色强度进行半定量判定,分数标准是:无色为0分;弱阳性染色强度淡黄色为1分;中等染色强度即棕黄色为2分;强阳性即棕褐色为3分。免疫反应的得分取阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积为免疫反应的得分。由此0-2分为阴性结果,3-6分为阳性结果。细胞培养:用于实验的食管鳞癌细胞株TE-1细胞株以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规传代培养。1.过氧化氢对人食管鳞癌细胞株TE-1细胞增殖及周期的影响:将细胞分为对照组、氧化应激组。氧化应激因素:500μmol/LH₂O₂。通过CCK-8比色法观察氧化应激不同时间后细胞的存活情况;通过PI染色结合流式细胞术检测H₂O₂作用于TE-1细胞不同时间细胞周期阻滞情况。确定24h为H₂O₂诱导G2/M期阻滞的时间点。2.人食管鳞癌细胞TE-1中Hsp90α和Cyclin B1的表达:采用Western Blot方法,检测并比较经不同实验时间组处理的TE-1细胞中Hsp90α和其底物蛋白CyclinB1蛋白水平的表达,探讨过氧化氢对Hsp90α及其底物蛋白CyclinB1在蛋白水平的表达是否与组织学实验具有一致性。3.统计方法分析连续性变量时,两组检测结果间比较采用Student’s two-tailed t-test检验,两组以上用one-way ANOVA检验。分析非连续性变量时,采用Chi-Square test和Spearman’s correlation rank分析。生存分析采用Kaplan-Meier绘制生存曲线,采用log-rank test分析差异显著性。P<0.05有统计学意义。结果:1.Hsp90α和CyclinB1蛋白在食管鳞癌中的表达情况食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管粘膜中Hsp90α的阳性表达位于胞浆,胞核有少量着色,癌旁或正常组织中Hsp90α的表达较弱。在81例食管鳞癌患者中,-/+者为 12.30%（10/81）,++者为 41.98%（34/81）,+++者为 45.70%（37/81）;CyclinB1的阳性表达位于上皮细胞的细胞质中,呈棕褐色,少数在细胞质和细胞核中同时表达.在正常食管黏膜组织中没有表达或弱表达。在65例食管鳞癌患者中,-/+者为 32.31%（21/65）,++者为 44.61%（29/65）,+++者为24.61%（16/65）。2、Hsp90α和CyclinB1蛋白表达和临床病理特征的关系Hsp90α的表达与肿瘤的部位、大小、浸润深度、是否有淋巴结转移均无显著性差异（P>0.05）,而与临床分期有显著性差异（P<0.05）（Table.2）。CyclinB1的表达与肿瘤的浸润深度、是否有淋巴结转移均无显著性差异（P>0.05）,而与肿瘤分期及临床分期及大小有显著性差异（P<0.05）（Table.2）。3、Hsp90α和CyclinB1蛋白在鳞癌及其在角化珠表达的特征与关系在41例配对的切片,分别检测Hsp90α和CyclinB1这两个蛋白,选取同一切片区域对结果进行评价分析。结果表明两者的表达呈正相关,即Hsp90α表达越高,CyclinB1表达越高（P<0.05,Gamma=0.503）。另在显微镜下共选取44个形态一致的角化珠,分别评价Hsp90α和CyclinB1的表达量。结果表明Hsp90α和CyclinB1在角化珠的表达呈负相关,即Hsp90α表达越高,CyclinB1表达越低（P<0.05,Gamma=-0.692）。Table3,Fig4。4、Hsp90α和CyclinB1表达水平与食管鳞癌患者预后的关系对本研究中72例食管鳞癌有生存资料的患者做Hsp90α的5年总体生存率为33.33%（24/72）,Hsp90α低表达和高表达的五年生存率分别为63.16%（12/19）和29.27%（12/41）。Kaplan-Meier分析结果显示72例食管鳞癌患者Hsp90α高表达患者的总体生存情况低于Hsp90α低表达患者,结果有统计学意义（P=0.002.log rank检验）。Hsp90α在鳞癌表达越高,患者的生存时间也越短,提示预后越差。对本研究中45例食管鳞癌有生存资料的患者做CyclinB1的5年总体生存率为33.33%（15/45）;Cyclin B1低表达和高表达的五年生存率分别为75%（12/16）和11.11%（3/27）。Kaplan-Meier分析结果显示45例食管鳞癌患者Cyclin B1高表达患者的总体生存情况低于CyclinB1低表达患者,结果有统计学意义（P=0.002.log rank检验）。CyclinB1在鳞癌表达越高,患者的生存时间也越短,提示预后越差。H₂O₂建立的TE-1细胞氧化应激模型1.H₂O₂诱导的氧化应激抑制细胞活力在浓度50μM的条件下,H₂O₂对细胞的活力抑制呈时间依赖效应。随着作用时间的延长,对TE-1细胞增殖的抑制程度逐渐增强。（细胞活力:对照组>氧化应激6h组、24h组、48h,P<0.05）;2.H₂O₂诱导的氧化应激细胞周期出现G2/M期阻滞。在浓度5000μM的条件下,H₂O₂对细胞的周期影响出现时间变化而变化。G2/M期:对照组<氧化应激6h组、24h组,P<0.05;3.H₂O₂诱导的氧化应激细胞胞内可溶性蛋白的改变H₂O₂处理后细胞内Hsp90α表达随着处理时间的增加逐渐减少,CyclinB1表达随着处理时间的增加逐渐增加;结论1.Hsp90α、CyclinB1的表达与不同的肿瘤生长部位、淋巴结转移个数、肿瘤浸润深度无相关性;Hsp90α、CyclinB1与肿瘤TNM分期存在相关性,提示Hsp90α和Cyclin B1可以作为评价TNM分期的一个潜在指标。Hsp90α和Cyclin B1高表达提示患者预后较差。2.Hsp90α和CyclinB1蛋白在鳞癌表达呈正相关关系,但其在角化珠表达呈负相关关系。提示Hsp90α在鳞癌中与CyclinB1起协同作用。但在鳞癌角化珠内Hsp90α与Cyclin B1是拮抗作用。3.H₂O₂作用于TE-1细胞不同时间,对细胞产生的氧化应激损伤增强,在24h出现明显的G2/M期阻滞,对细胞增殖抑制。4.氧化应激导致细胞内Hsp90α减少而CyclinB1蓄积,与组织中角化珠实验结果相一致,提示高分化食管鳞癌组织中角化珠的形成可能涉及氧化应激机制。