目的:甲醛是一种广泛应用的有机化工原料,主要用于合成装修材料、防腐剂和衣物抗皱剂等产品,由于这些产品中存在的游离甲醛易挥发,因此人们在生产和生活中会经常接触到甲醛。研究表明,甲醛可能与鼻咽癌、哮喘、肺癌、阿尔茨海默病和白血病等多种疾病相关,是一种潜在的致癌物。但由于甲醛的高反应性,目前对于甲醛造成远端组织损伤存在较大争议。我们的前期研究发现,肺癌患者以及苯并[a]芘致肺癌小鼠的血浆丙二醛含量增高,抗氧化水平下降且外周血单个核细胞线粒体功能明显下降,说明肿瘤患者的免疫功能明显降低。文献报道,甲醛暴露可以对免疫细胞的数量和功能产生影响,但机制尚不明确。由此,我们猜测甲醛可能导致机体免疫细胞线粒体功能下降,从而促进其他有害因素所致疾病的发生发展。我们利用小鼠进行甲醛暴露实验,结果发现甲醛并未造成T、B淋巴细胞的线粒体功能下降,却导致了T淋巴细胞的线粒体活性氧mROS水平下降,而在体外实验中甲醛导致了活化的T淋巴细胞线粒体功能下降,mROS水平升高。mROS是T淋巴细胞激活过程中必不可少的第二信号,对于SPF级小鼠其T淋巴细胞多为未活化的状态,且未活化的T淋巴细胞依靠脂肪酸氧化和氧化磷酸化供能代谢水平低,而活化的T淋巴细胞依靠有氧糖酵解供能代谢水平高,易发生凋亡,二者对外界刺激的反应不同。所以本研究分别探究了甲醛对未活化的T淋巴细胞和活化的T淋巴细胞的影响及相关机制,结果发现甲醛对于未活化的T淋巴细胞和活化的T淋巴细胞产生的影响不同,可能为甲醛所致疾病的预防和治疗提供新的思路。研究方法:本实验通过动式吸入染毒的方式建立小鼠气态甲醛暴露模型,明确甲醛对小鼠T、B淋巴细胞功能的影响。利用血常规、流式细胞术和化学发光法分别检测甲醛暴露小鼠外周血细胞计数、外周血和脾脏T、B淋巴细胞MMP水平以及外周血单个核细胞ATP水平探究甲醛对外周血细胞数量和T、B淋巴细胞线粒体功能的影响;应用mito SOXTM染色检测甲醛对小鼠外周血和脾脏的T、B淋巴细胞mROS含量的影响;利用电化学发光法检测甲醛对小鼠血浆细胞因子产生情况的影响。应用甲醛暴露小鼠和原代脾脏淋巴细胞经ConA给药建立激活T淋巴细胞的动物模型和体外细胞培养模型,明确甲醛对T淋巴细胞激活的影响。检测小鼠血浆细胞因子水平、T淋巴细胞mROS水平和原代T淋巴细胞的细胞因子水平探究甲醛对T淋巴细胞激活的影响。使用原代脾脏淋巴细胞甲醛暴露确定甲醛对未活化T淋巴细胞激活影响的相关机制。应用蛋白免疫印迹实验和免疫共沉淀实验检测原代脾脏淋巴细胞中线粒体动力相关蛋白DRP1表达变化及与其受体MFF和FIS1结合的情况说明线粒体分裂在甲醛暴露所致损伤中的作用。使用甲醛暴露的原代脾脏淋巴细胞给药ConA激活T淋巴细胞,检测T淋巴细胞mROS水平和细胞因子产生情况进一步明确甲醛对T淋巴细胞激活的影响。使用小鼠原代脾脏淋巴细胞经ConA激活获得的活化的T淋巴细胞和T淋巴细胞系Jurkat E6-1建立甲醛暴露对活化的T淋巴细胞影响的细胞培养模型,明确甲醛暴露对活化的T淋巴细胞的影响及相关机制。检测活化的T淋巴细胞的mROS、线粒体功能和凋亡水平探究甲醛对活化的T淋巴细胞损伤情况。使用活性氧清除剂NAC和甲醛同时暴露,检测活化的T淋巴细胞的氧化和抗氧化水平、线粒体功能和凋亡水平明确氧化损伤在甲醛所致活化T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡中的作用。氧化损伤是导致线粒体损伤的一个重要因素,我们应用线粒体动力相关蛋白DRP1的选择性抑制剂Mdivi-1和甲醛同时暴露,明确线粒体损伤分裂在甲醛所致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡中的作用。检测活化的T淋巴细胞DRP1表达及其在Ser616位点的磷酸化水平以及与其受体MFF和FIS1结合情况确定线粒体分裂相关蛋白表达变化;透射电镜观察活化的T淋巴细胞线粒体形态、结构变化;检测活化的T淋巴细胞氧化和抗氧化水平、线粒体功能障碍和细胞凋亡情况进一步说明线粒体损伤分裂在甲醛所致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡中的作用。结果:1、甲醛暴露导致小鼠未活化的T淋巴细胞mROS水平显著下降为探究甲醛对小鼠T、B淋巴细胞的影响,我们检测了小鼠脾脏T、B淋巴细胞MMP水平、外周血单个核细胞ATP含量、mROS水平及血浆细胞因子水平。结果显示,与对照组相比,各甲醛暴露组的T、B淋巴细胞MMP、外周血单个核细胞ATP含量和血浆细胞因子水平并没有明显变化;3 mg/m3和5 mg/m3甲醛暴露的小鼠与对照组相比T淋巴细胞mROS水平明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。mROS是T淋巴细胞激活所必须的刺激信号,同样也反映了线粒体代谢水平,说明甲醛可能通过减少T淋巴细胞刺激信号mROS的产生阻碍T淋巴细胞的激活。2、甲醛通过降低mROS水平导致未活化的T淋巴细胞激活受阻为探究甲醛是否通过减少mROS产生抑制了未活化T淋巴细胞的激活,我们使用ConA激活甲醛暴露小鼠的T淋巴细胞,检测小鼠血浆细胞因子和T淋巴细胞的mROS水平,结果显示,给药ConA后,甲醛暴露组小鼠与对照组小鼠相比,血浆细胞因子和T淋巴细胞mROS水平均显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。线粒体正常增殖分裂是维持mROS生理平衡的基础,甲醛使T淋巴细胞活化产生的mROS水平和血浆细胞因子水平降低,说明甲醛可能通过抑制线粒体增殖分裂阻碍未活化T淋巴细胞的激活。3、甲醛通过抑制DRP1与其受体MFF结合阻碍未活化的T淋巴细胞激活为了验证甲醛是否通过抑制线粒体增殖分裂阻碍了未活化的T淋巴细胞的激活,我们检测了体外培养的未活化淋巴细胞的mROS水平、线粒体功能及凋亡情况。结果显示,与对照组相比,甲醛暴露的未活化T淋巴细胞mROS和ATP水平明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,MMP和凋亡水平并没有明显变化,这些结果表明甲醛抑制了线粒体产能。线粒体增殖分裂相关蛋白表达结果显示,甲醛使未活化淋巴细胞的DRP1蛋白表达明显下降,并减少其在Ser616位点的磷酸化使DRP1与其增殖分裂受体MFF的结合明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。说明甲醛抑制线粒体的增殖分裂导致mROS水平降低。ConA给药激活甲醛暴露的原代脾脏淋巴细胞后,甲醛组T淋巴细胞的细胞因子水平明显下降,mROS水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。综上表明甲醛通过抑制DRP1与其增殖分裂受体MFF的结合阻碍线粒体增殖分裂进而减少能量和mROS产生,从而阻碍T淋巴细胞的激活。4、甲醛通过产生大量mROS导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡为探究甲醛暴露对活化的T淋巴细胞线粒体功能的影响,我们检测了体外培养活化的T淋巴细胞甲醛暴露后mROS水平、线粒体功能和凋亡情况。结果显示,与对照组相比,T淋巴细胞的mROS水平和凋亡比例明显升高,ATP含量和MMP水平明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。说明甲醛暴露可能通过氧化损伤导致了活化的T淋巴细胞的线粒体功能障碍和凋亡。为验证甲醛暴露是否通过氧化损伤导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡中的作用,我们使用活性氧清除剂NAC和甲醛同时暴露,检测活化的T淋巴细胞的氧化与抗氧化水平、mROS水平、线粒体功能和凋亡情况。结果显示,与对照组相比,甲醛组SOD、GSH-Px和GSH/GSSG水平明显下降,MDA水平明显升高。活性氧清除剂NAC给药后抗氧化水平明显恢复,MDA、mROS水平和凋亡比例明显下降,ATP含量和MMP水平得到了明显恢复,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。说明甲醛确实通过氧化损伤导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡。5、甲醛通过增加DRP1与受体FIS1结合导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡氧化损伤是导致线粒体损伤分裂的一个重要因素,为探究甲醛是否通过线粒体损伤分裂导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡中的作用,我们使用DRP1的选择性抑制剂Mdivi-1和甲醛同时作用,检测活化的T淋巴细胞线粒体损伤分裂相关蛋白的表达以及Mdivi-1对细胞表型的恢复情况。结果显示,与对照组相比,甲醛组的T淋巴细胞中DRP1蛋白变化不明显,p-DRP1（Ser616）的蛋白表达水平明显上升,DRP1与受体FIS1的结合明显升高,Mdivi-1给药后DRP1、p-DRP1（Ser616）的蛋白表达水平及与受体结合情况均明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,甲醛组细胞线粒体结构不清,数量减少,Mdivi-1的使用可以减轻甲醛对线粒体损伤（P＜0.05）;甲醛给药组与甲醛组相比,Mdivi-1给药后抗氧化水平明显恢复,MDA、mROS和凋亡水平明显下降,ATP含量和MMP水平也明显恢复,且差异有统计学意义（P＜0.05）。说明甲醛确实通过氧化损伤引起线粒体损伤分裂导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡。结论:1、甲醛通过抑制DRP1与线粒体增殖分裂受体MFF结合减少线粒体增殖分裂,使T淋巴细胞激活所需的刺激信号mROS减少,从而导致未活化的T淋巴细胞激活受阻。2、甲醛通过促进DRP1与线粒体损伤分裂受体FIS1结合增加线粒体损伤分裂,导致活化的T淋巴细胞线粒体功能障碍和凋亡。