背景与目的：　　人类急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种严重危害人类健康和生命的疾病，对于它的治疗临床多采用化疗的方式，而传统的化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也产生很大的毒副作用，从而引起感染、出血等严重的并发症；除此之外，肿瘤细胞长期以来对化疗药物产生的耐受性也成为影响治疗效果的重要因素，所以寻找一种高效低毒的抗肿瘤药物势在必行。近年来，各专家学者对生物毒素如蛇毒的研究发现，其组分能显著抑制多种肿瘤细胞增殖，为临床抗肿瘤治疗及新药开发提供了新的思路。　　舟山眼镜蛇毒细胞毒素1（Cytotoxin1，CTX1）是本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化出的一种碱性小分子多肽，该多肽由60个氨基酸残基组成，分子质量为6698Da，氨基酸序列为LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。前期研究结果表明CTX1对多种白血病细胞具有选择性杀伤作用，主要引起晚期凋亡和坏死。进一步的研究表明其引起的死亡或为新近发现并一度成为热点的区别于传统凋亡和坏死的一种新的死亡方式，即经过严格的信号转导调控的程序性坏死，又称Necroptosis。　　Necroptosis是近年发现的一种新的区别于传统坏死的死亡方式，它在形态上主要表现为细胞肿胀，细胞膜完整性受到破坏等坏死的形态特征，但在分子生物学方面，它是经过以RIP1为主的一系列蛋白的严格信号转导调控的，是一种诱导性的死亡方式。　　本研究通过探讨CTX1诱导急性早幼粒白血病细胞株HL-60和急性髓性白血病细胞株KG1a这两种分化程度和干性程度不同的细胞株的死亡机制来阐明CTX1作用于肿瘤细胞的靶点及机制。主要研究内容有：1）CTX1诱导死亡过程中各相关死亡蛋白的表达；2) CTX1诱导死亡过程中ROS的作用；3）CTX1诱导细胞死亡过程中TNF-α的作用；4）干扰RIP1基因表达对CTX1诱导HL-60死亡的影响；5）CTX1对正常小鼠骨髓单个核细胞的毒性作用；6）CTX1对溶酶体通透性的影响；　　实验方法：　　1.蛋白免疫印迹（Western Blot）法　　检测CTX1作用于两种细胞后各死亡相关蛋白Caspase8、RIP1、RIP3的表达情况；　　2.流式细胞（flow cytometry）术　　用CM-H2DCFDA标记ROS，检测CTX1作用于细胞后ROS的产生情况；干扰RIP1后，Annexin V-FITC/PI双染检测CTX1对HL-60细胞的影响；　　3. MTS法　　检测TNF-α中和抗体预处理后CTX1对HL-60的影响；　　4.ATP法（CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay）　　检测CTX1对正常小鼠骨髓单个核细胞（Bone Marrowmononuclear Cell，BMNC）的影响；　　检测ROS阻断剂NAC预处理后CTX1对KG1a细胞的影响；　　检测TNF-α中和抗体预处理后CTX1对KG1a的影响；　　5. ELISA方法　　检测CTX1作用于细胞后上清液中TNF-α的产生情况；　　6.慢病毒载体构建及转染　　构建针对RIP1基因的慢病毒载体，转染HL-60细胞，构建干扰RIP1表达的稳定转染的HL-60细胞株；　　7.荧光显微镜方法　　观察病毒载体侵染细胞后细胞内GFP荧光以检测病毒转染情况；　　8.激光共聚焦技术　　观察CTX1作用于细胞后吖啶橙染色情况；　　结果：　　1. CTX1诱导死亡过程中各相关死亡蛋白的表达情况　　采用Western blot的方法检测蛋白表达发现，CTX1作用于HL-60后引起RIP1明显上调，RIP3略微下降，凋亡相关蛋白酶Caspase8下降，并呈现剂量依赖和时间依赖性；CTX1作用于KG1a后引起RIP3显著升高，RIP1略有下调，Caspase8下降，也呈现剂量依赖和时间依赖性；说明CTX1诱导细胞死亡过程中，RIP1在HL-60细胞中，RIP3在KG1a细胞中分别起到很关键的作用。　　2. CTX1诱导细胞死亡过程中活性氧ROS的作用　　用探针 CM-H2DCFDA标记 ROS后流式细胞术检测发现，CTX1作用于KG1a后引起 ROS显著升高，与对照组相比具有显著性差异（p<0.05）；而作用于HL-60后，ROS的产生量相对于对照组并没有升高，反而有所降低；提示ROS在KG1a死亡的下游途径中可能发挥了一定的作用，而HL-60的死亡可能与ROS没有很大的关系；但是应用NAC预处理KG1a细胞阻断ROS之后，发现KG1a的死亡并没有得到逆转，说明ROS的升高在CTX1诱导KG1a细胞死亡过程中或只是一过性的，并不是关键执行因素；　　3. CTX1诱导细胞死亡过程中TNF-α的作用　　CTX1作用于两种细胞后，应用ELISA的方法检测上清液中TNF-α的量发现，CTX1作用于KG1a细胞和HL-60细胞后都能引起TNF-α不同程度的升高，但是KG1a细胞升高幅度较大；应用TNF-α中和抗体预处理后，检测CTX1对两种细胞的作用发现并不能逆转两种细胞的死亡；提示CTX1作用于细胞后能引起炎性因子TNF-α升高，但是它并不是导致细胞死亡的关键因素。　　4.干扰RIP1的表达对CTX1诱导HL-60细胞死亡的影响　　用慢病毒转染的方式构建针对RIP1的稳定转染的细胞株，用流式细胞术检测CTX1对细胞株的作用发现，干扰RIP1基因表达后并不能逆转HL-60细胞的死亡。说明 RIP1在HL-60细胞死亡过程中作用很关键但并不是唯一关键的因素。　　5.高浓度CTX1对小鼠正常骨髓单个核细胞的作用　　用ATP的方法检测CTX1对小鼠骨髓单个核细胞的作用发现，CTX1对小鼠正常骨髓单个核细胞并没有明显杀伤作用，在浓度达到5倍 HL-60细胞IC50的浓度时，对正常细胞的毒性只有10％左右，说明CTX1对肿瘤细胞具有高度选择性且安全范围较宽。　　6. CTX1对溶酶体通透性影响　　激光共聚焦显微镜观察吖啶橙（AO）染色发现，与对照组相比，CTX1加药组，溶酶体所染红色荧光变弱，且随着时间的延长，荧光逐渐减弱，提示CTX1作用于细胞后能引起溶酶体通透性升高。　　结论：　　1. CTX1能够诱导KG1a和HL-60以一种新的程序性坏死的方式死亡　　2. CTX1诱导KG1a和HL-60程序性坏死的下游途径存在不同的机制　　3.高浓度的CTX1对正常小鼠骨髓单个核细胞没有明显杀伤作用，提示CTX1的安全范围较宽。　　4. RIP1可能不是HL-60死亡过程中唯一的关键因子。　　5. CTX1作用的靶点或与溶酶体有关。