蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓体内提取的同时具有纤溶酶活性和纤溶酶原激活活性的蛋白质,是一种具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质的血栓病治疗药物,应用前景广泛。本文以环氧基活化后偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球为载体固定化蚯蚓纤溶酶,为蚯蚓纤溶酶的分离纯化提供理论依据。具体内容如下:(1)以Fe304纳米粒子为磁核,戊二醛为交联剂,span-80为乳化剂制备磁性壳聚糖微球,其最佳工艺条件:壳聚糖溶液浓度10 mg·mL-1,油水比5:1,搅拌速率600 r·min-1,戊二醛体积分数3%(v/v)。通过红外光谱、扫描电镜、磁强计等对磁性壳聚糖微球的物性进行表征,结果表明微球粒径分布均一分散性好,成功包裹Fe304粒子后最小粒径为215 nm。通过磁响应性分析该微球的饱和磁强度为67 emu·g-1,具有超顺磁响应性。(2)以环氧氯丙烷为活化剂对制备得到的磁性壳聚糖微球进行活化,其最佳工艺条件:二甲基亚砜体积分数50%(v/v),环氧氯丙烷体积分数40%(v/v),NaOH浓度1.6 mol·L-1,反应时间4h,活化温度40℃,微球表面环氧基修饰密度为211 μmol·g-1。(3)以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基偶联到活化的微球上,得到微球偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的最佳工艺条件:pH7,反应时间6 h,振动转速200 r·min-1,大豆胰蛋白酶抑制剂含量16%(v/v),大豆胰蛋白酶抑制剂的偶联率为14 mg·g-1微球。(4)以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基偶联的磁性壳聚糖微球为载体,对蚯蚓纤溶酶固定化,得最佳工艺条件:反应时间2.5 h,pH 7.5,微球与蚯蚓纤溶酶的固液比1:20,酶浓度15 KU·mL-1,得固定化蚯蚓纤溶酶最高活性为166U·mg-1,活力回收率为55%。固定化与游离蚯蚓纤溶酶具有相似的酶学性质,但固定化酶的耐酸碱性较游离酶更好,稳定范围更宽;储藏稳定性好,4℃保存30天后酶活仍保留78%而游离酶仅保留32%;随温度升高固定化和游离蚯蚓纤溶酶活性减小趋势逐渐增大,酶失活速率加快,当温度超过60℃时,两者失活现象明显,但固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性明显优于游离酶。动力学分析表明,在30～60℃范围内,固定化和游离蚯蚓纤溶酶热失活的表观活化能分别为130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。