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研究背景:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见的并发症,常以损害视网膜血管微循环,导致视网膜渗出、出血、纤维增殖、新生血管形成为主要病理特征。随着我国人口的老龄化,DR的发病率逐年升高,目前已经成为眼科疾病中主要的致盲眼病之一,不仅如此,随着糖尿病患者的发病年纪越来越小,DR的发病年龄也趋于年轻化。到目前为止,DR的发病机制虽然并不完全清楚,但学者们公认为DR是以糖代谢紊乱为病理基础,引起眼组织、神经及血管微循环改变,造成眼的营养和视功能损坏的慢性疾病。研究表明,炎症反应伴随着DR发生发展的整个过程,视网膜血管内皮细胞(Retinal endothelial cells,RECs)的炎症损伤在DR发病的早期阶段就可以发生。RECs是视网膜血管的结构基础,具有非常重要的生理功能,其代谢活跃,能够直接迅速感知血液中的代谢物质变化并作出应激反应,尤其是血糖和血压的变化,长期反复的高血糖高血压或血糖血压的大幅度波动不仅会造成细胞的功能障碍,更会引发其不可逆的损伤甚至死亡。NLRP3炎性小体属于机体内固有免疫系统,是人体的第一道免疫防线,发挥重要的免疫监视作用。近年来,NLRP3炎性小体的激活在糖尿病视网膜病变的发病机制中的作用成为了研究热点。其特异性抑制剂Mcc950是一种含二芳基磺酰脲的复合物,能够在多种自身炎症性疾病模型中有效抑制炎症反应,但Mcc95在糖代谢紊乱造成的无菌性免疫疾病模型并未得到讨论。目的:研究Mcc950对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:第一部分:探究体内糖网增殖膜内视网膜血管内皮细胞中的NLRP3炎性小体的激活。临床样本收集及分组:正常视网膜组和糖网增殖膜组。免疫荧光(Immunofluorescence)和免疫印迹(Western Blot)方法检测NLRP3炎性小体相关蛋白的表达。第二部分:探究Mcc950对高糖诱导的体外视网膜血管内皮细胞损伤的干预作用。HRECs培养及分组:正常对照组、高糖刺激组(按浓度分亚组)、Mcc950干预组(根据浓度分亚组)。CCK8法分别检测高糖或者Mcc950对细胞增殖和活力的影响,以及Mcc950干预对高糖诱导的细胞增殖和活力的影响。Elisa法检测单纯高糖或者Mcc950干预后的HRECs上清液中的炎症介质IL-1β的表达水平。免疫荧光观察高糖刺激对比Mcc950干预后HRECs内NLRP3炎性小体激活的变化。TUNEL法验证高糖刺激下细胞的凋亡程度以及Mcc950干预后细胞凋亡的情况变化。实时荧光定量PCR(RT-PCR)法探究NLRP3炎性小体相关因子转录表达情况。免疫印迹检测高糖刺激对比Mcc950干预HRECs内炎性因子的蛋白表达变化。免疫共沉淀方法分析在高糖刺激后,Mcc950是否通过作用于NLRP3与NEK7相互作用从而产生干预效果。结果:CCK8法结果显示:高糖浓度在15mM时,细胞增殖活力增加,当高糖浓度增加-到30或者50mM时,细胞活力明显下降,细胞凋亡明显。Mcc950浓度在0.1,1,10μM时,对细胞活性无明显影响,当浓度达到100μM时,细胞活性稍有下降,但并无统计学差异。在30mM高糖环境下,HRECs经过Mcc950预处理(0.1,1,10,100)后细胞活性均较高糖刺激组有所恢复(P<0.05)。Elisa法结果显示:在30mM高糖环境下,细胞上清液中的IL-1β的浓度随着高糖刺激时间的延长而增高。相对于高糖刺激组,经过Mcc950预处理组(0.1,1,10,100μM)的IL-1β的浓度均减少(P<0.05)。RT-PCR结果显示:高糖刺激后NLRP3,Caspase-1,IL-1β的mRNA表达明显增加,但Mcc950的处理结果并没有统计学差异。Western Blot结果显示:糖网增殖膜相较于正常视网膜组织中检测到的NLRP3,Caspase-1,IL-1β表达均增高。体外培养的HRECs实验发现与正常对照组相比,高糖组细胞内NLRP3,pro-Caspase-1,Caspase-1,pro-IL-1β,IL-1β蛋白表达增高,Mcc950处理组与高糖组相比,NLRP3,pro-Caspase-1,pro-IL-1β的蛋白表达依旧增高,而Caspase-1,IL-1β的蛋白表达则明显降低(P<0.05)。免疫荧光结果显示:糖网增殖膜相较于正常视网膜组织中CD31标记的血管内皮细胞内可见NLRP3与IL-1β明显的共染。体外实验中,高糖组较正常组的HRECs内NLRP3与IL-1β双染也明显增加,Mcc950处理组较高糖组的双染细胞比率明显下降(P<0.05)。TUNEL法显示:Mcc950处理组的细胞凋亡率较高糖组明显减低(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示:高糖刺激下NLRP3与NEK7结合明显高于对照组,Mcc950处理组NLRP3与NEK7的相互作用较高糖组明显降低(P<0.05)。结论:高糖可以刺激人视网膜血管内皮细胞内的NLRP3炎性小体的激活,造成细胞的炎性损伤甚至凋亡。Mcc950通过干扰Nek7-NLRP3相互作用的途径有效抑制人视网膜血管内皮细胞在高糖诱导下的炎症损伤。这为DR的病理机制的深入理解及新兴治疗药物的发展提供了新思路。