羊传染性脓疱病(Orf)又称羊传染性脓疱性皮炎,俗称羊口疮,是由口疮病毒(ORFV)引起的山羊和绵羊的一利,急性、接触性传染病。其特征是患羊口唇等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂。羔羊最易患病,多为群发。本病在世界各地均有发生,我国北方、西北等养羊较多的地方也较常见,是羊的主要疫病之一。由于病毒的抵抗力强,羊群一旦被感染则不易清除,可持续危害羊群多年,给畜牧业造成一定的经济损失。ORFV病毒属痘病毒科,副痘病毒属。病毒粒子呈砖形或椭圆形,其表面呈绳索样纵横交错排列结构,颗粒外面有一层膜。该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长,并产生细胞病变。ORFV引发病灶的组织病理学特征包括角化细胞的空泡和肿胀,细胞间质变性,表皮增生显著,表皮内微肿胀,皮下组织中性粒细胞、树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞聚集,痂皮壳形成等。羊口疮的诊断主要根据典型的症状来诊断,目前所采用的实验室诊断,常用的包括PCR、ELISA、电镜,其他的还有组织病理学、Western blotting、限制性片段长度多态性(RFLP)分析等等。Sullivan JT等最早以B2L基因为目的片段进行PCR扩增,由于其高检出率和高特异性,使其成为目前最常用的检测ORFV的PCR方法。在国内,赵魁等对ORFV吉林松原株,Zhang K等对ORFV湖北株,分别针对ORFV的B2L基因进行了PCR检测和系统发育分析。向智龙等以ORFV的保守基因H2L基因为目的片段进行PCR扩增,也有较高的特异性和检出率。羊口疮分布广泛,具有较强的动物传染性,如果爆发会造成不小的经济损失。由于病毒容易在结痂部位存活很长时间,能造成重复感染,再加上目前还没有很好的疫苗能够提供长时间有效的保护,所以其控制仍比较困难。现在使用的活疫苗会造成皮肤损害,留下结痂,有利于病毒存活,使发生再次感染或其他动物受感染的机会增加。由于传统疫苗的副作用,研发新的亚单位疫苗就很有必要。对于羊口疮的预防,要求控制羊的引进来源,做好检疫和消毒工作。在羊口疮流行的地区,定期接种疫苗有助于预防疾病爆发。对于受感染的动物,目前还没有特效的治疗药物。常用的处理措施是对损伤部位的局部清洗,并使用抗生素控制继发感染。在国内,会使用有去腐生肌、消炎止痛作用的中药辅助治疗羊口疮。而在国外,化疗药物也被用于治疗感染ORFV的人及动物。其中,西多福韦对多种痘病毒具有很强的对抗作用。它能减轻病羊的损伤程度和皮肤损伤持续时间,减少存在于皮肤损伤部位的病毒数量。最近有报道使用西多福韦/硫糖铝混合胶体喷洒药剂治疗感染ORFV的羊羔,取得了不错效果。目前,人们对羊口疮病毒的免疫机制尚不明了,也没有发现相关的保护抗原。近日,羊口疮在中国北方省份如吉林省爆发,然而由于缺乏特定的抗体,对羊口疮病毒的研究及羊口疮的控制仍止步不前。因此,我们决定构建针对原始病毒蛋白的单抗并且藉此法鉴定更多的免疫原。本研究用纯化的羊口疮病毒吉林株(ORFV Jilin)蛋白作为抗原免疫小鼠,通过此方法一次可以获得多株针对不同免疫原的单克隆抗体,并且用间接ELISA的方法对抗ORFV蛋白的单克隆抗体进行初筛。我们一共构建了10株单抗,其中4E1杂交瘤株经Western-blot鉴定发现能与19kDa和70kDa的蛋白有显著的相互作用,因此我们对其进行了3次亚克隆并且腹腔注射入小鼠体内生产腹水,然后,从小鼠腹水中纯化单抗。利用纯化的单抗通过免疫沉淀的方法沉淀出相应的病毒蛋白。将沉淀的蛋白利用质谱技术分析发现这株抗体识别的蛋白为ORFV-Jilin ORFV086。紧接着,为了验证免疫沉淀及质谱鉴定结果的真实性,ORFV086全长、f1、f2基因通过PCR技术从羊口疮病毒吉林株基因组中扩增出来,并将所得的目的基因分别克隆至pCMVTag4A表达载体,重组质粒转染进OFTu细胞进行真核表达,然后通过Western-blot检测。结果显示,利用PCR技术成功克隆了ORFV086基因全长(ORFVO86: Accession No.:JQ729675)及f1、f2片段,经测序并与GenBank中序列进行比对,结果完全一致,大小分别为2718bp、987bp和1731bp。并且将所得的目的基因分别克隆至pCMVTag4A表达载体,经PCR、限制性酶切分析和测序等鉴定,成功构建了pCMVTag4A-ORFV086、pCMVTag4A-ORFV086f1和pCMVTag4A-ORFV086f2重组质粒。重组质粒在OFTu细胞成功表达出融合蛋白,表达产物经Western-blot技术检测,结果表明纯化的单克隆抗体4E1能特异的识别ORFVO86。免疫荧光、免疫组化和病毒中和实验用于检测单克隆抗体4E1在疾病诊断和亚单位疫苗研制方面的价值。将羊口疮病毒ORFV Jilin株感染OFTu细胞,于感染后不同时间收集细胞进行免疫荧光检测,结果表明,早在病毒感染12h后即可检测到病毒。采集具有典型羊口疮临床表现的患羊皮肤病变标本,通过免疫组化分析表明单克隆抗体4E1能特异的检测到病毒感染局限于表皮层角化细胞和侵润在皮下的少量炎症细胞,皮下连接组织未见病毒。用病毒与单克隆抗体4E1中和1h后再感染OFTu细胞,24h后收集细胞通过免疫荧光方法检测荧光病变反应,利用正常鼠血清作阴性对照,判断单克隆抗体4E1的病毒中和能力,从而为ORFV086用于亚单位疫苗的研制提供理论依据,病毒中和实验的结果表明,单克隆抗体在稀释1000倍后仍然具有中和能力(P=0.003<0.05)。本研究所有的结果都表明抗ORFV086抗体4E1是特异的,它将成为病毒入侵机制以及免疫诊断试剂和亚单位疫苗的研发的有力工具。正如我们在结果中展示的一样,单抗4E1可以通过ELISA、Western-blot、免疫组化技术用于疾病的诊断和流行病学调查,利用免疫沉淀、免疫荧光和细胞免疫化学方法研究疾病发生机制,同时是亚单位疫苗和治疗性药物的研发成为可能。