【摘 要】
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目的:筛选牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白的优势B细胞表位,将筛选出的优势B细胞表位序列进行串联优化,构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,并进行诱导表达和纯化。用重组蛋白免疫动物后,进行免疫保护效果评价。方法:采用生物信息学分析工具Prot Param、TMHMM、Net Phos、DNAstar软件、S OPMA、SWISS-MODEL、B
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目的:筛选牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白的优势B细胞表位,将筛选出的优势B细胞表位序列进行串联优化,构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,并进行诱导表达和纯化。用重组蛋白免疫动物后,进行免疫保护效果评价。方法:采用生物信息学分析工具Prot Param、TMHMM、Net Phos、DNAstar软件、S OPMA、SWISS-MODEL、Bepi Pred、Immunomedicine Group等对FimD、PilN和PilV蛋白进行理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构和B细胞表位预测,并进行综合分析,最终得出优势B细胞表位。串联牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白优势B细胞表位,并进行序列优化。构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,并转化到BL21（DE3）大肠杆菌中进行表达,利用PCR技术和双酶切技术进行鉴定。转化后的BL21（DE3）大肠杆菌,加入IPTG,在细菌振荡培养箱中以37℃,180 rpm进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳,分析重组蛋白的表达形式,并进行重组蛋白纯化,用Western-blot进行检测。制备弗氏佐剂与重组蛋白混合多表位疫苗,免疫小鼠后,制备鼠多克隆抗血清,利用间接ELISA方法检测抗体效价;测定牛源致脑炎大肠杆菌S9922 LD50,进行攻毒保护试验,记录小鼠攻毒后7天内的整体状况,并进行肝脏、脾脏和脑载菌量测定。结果:对FimD、PilN和PilV蛋白进行理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构等多种参数综合分析得到最终的优势B细胞表位,FimD蛋白:7-18、144-152、307-315、365-373;PilN蛋白:77-86、138-149、516-524;PilV蛋白:265-275、312-323、402-415。成功构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western-blot结果显示出现一条特异性条带,与预期的重组蛋白大小相符;制备的小鼠多克隆抗血清效价高达1:204800,Western-blot结果显示该血清可与重组表达蛋白发生特异性反应;试验组小鼠攻毒后存活率为66%;对照组小鼠肝脏、脾脏和脑载菌量均显著高于试验组。结论:本试验通过对牛源致脑炎大肠杆菌S9922 FimD、PilN和PilV蛋白进行综合分析,最终得出优势B细胞表位,成功构建原核表达载体p ET32a-FimD+PilN+PilV,重组蛋白以包涵体形式表达,制备多表位疫苗后,对其进行免疫效果的评价,结果显示该疫苗可以提高小鼠对牛源致脑炎大肠杆菌S9922的免疫力,可为牛源致脑炎大肠杆菌多表位疫苗的进一步研究奠定基础。
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