ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌重组菌毛对血管内皮细胞功能的影响

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目的:观察ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)重组菌毛蛋白rFimA对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达和分泌致炎细胞因子、粘附分子和趋化因子的影响,探讨P. gingivalis及其菌毛蛋白FimA在动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)发生发展中的可能作用以及作为牙周炎与As相关的物质基础的可能。方法:标准条件下厌氧培养ⅣfimA型P.gingivalis(W83),收集菌液提取细菌DNA,克隆ⅣfimA型Pgingivalis(W83)的fimA序列,构建fimA的原核表达系统pET-30a-FimA BL21DE3, IPTG诱导表达重组菌毛蛋白rFimA;体外培养HUVEC,待HUVEC单层融合后,分别加入纯化后不同浓度的Ⅳ型rFimA,共同培养2h、6h、24h,采用ELISA法测定培养上清液中致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子IL-8、MCP-1的分泌量;RT-PCR检测HUVEC中各致炎细胞因子和趋化因子以及粘附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平;FCM检测HUVEC表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达量。结果:(1)不同浓度Ⅳ型rFimA蛋白刺激HUVEC, ICAM-1的mRNA水平T5组(10.0μg/ml)在2h、6h、24h时均能刺激其表达,随时间推移,表达强度有升高趋势,但该浓度组在各时间点分泌的蛋白量与对照组比较差异无统计学意义,与基因表达水平不一致;VCAM-1蛋白表达与基因水平相符,在2h时各浓度组均不能刺激其表达,随时间延长,各浓度组刺激表达的能力逐渐增强,6h时T5组、24h时T3、T4、T5组与对照组比较差异有统计学意义,提示这种刺激作用存在时间依赖性;6h、24h时随浓度增加,刺激表达的能力亦有增强趋势。(2)不同浓度Ⅳ型rFimA蛋白刺激HUVEC 2h、6h、24h时,IL-1β和IL-6 mRNA水平和蛋白水平与对照组比较差异均无统计学意义,说明其表达对Ⅳ型rFimA不敏感,不能诱导其增强;TNF-αmRNA在2h未见其有表达,6h、24h时,各浓度组刺激表达的能力逐渐增强,6h时T5组及24h时T2、T3、T4、T5组都能刺激TNF-α的表达,提示这种刺激作用存在时间依赖性。分泌蛋白量与mRNA水平基本一致,但是24h时T2、T3两个浓度组与对照组比较差异无统计学意义。(3)不同浓度Ⅳ型rFimA蛋白刺激HUVEC, MCP-1和IL-8 mRNA表达水平随时间延长,各浓度组刺激表达的能力逐渐增强,作用具有时间依赖性;24h时MCP-1和IL-8 mRNA表达具有剂量依赖性,MCP-1和IL-8在各时间点蛋白表达量与基因水平基本一致,但24h时MCP-1和IL-8蛋白表达量不具有剂量依赖性。结论:本研究结果显示Ⅳ型rFimA蛋白能刺激粘附分子VCAM-1、致炎细胞因子TNF-α和趋化因子MCP-1、IL-8的表达,表明Ⅳ型rFimA可刺激并影响HUVEC的功能,参与As发生、发展,推测FimA可能是P.gingivalis促进As发生、发展的物质基础。
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