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草鱼（Grass carp,Ctenopharyngodon idella）是一种重要的淡水养殖鱼类,在我国广泛养殖。然而,草鱼易患多种疾病,尤其是由ds RNA组成的草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病（grass carp haemorrhagic disease,GCHD）影响最为严重。草鱼出血病主要危害当年鱼种或鱼苗,具有流行季节长,死亡率高等特点,对我国草鱼养殖行业造成巨大损失。截止目前,我国研究人员已经分离鉴定了50多株病毒,根据基因组序列的差异,可分为三种基因型:以GCRV-873毒株为代表的GCRV-Ⅰ型、GCRV-HZ08毒株为代表的GCRV-Ⅱ型和HGDRV毒株为代表的GCRV-Ⅲ型。不同基因型毒株的序列差异较大,其核苷酸的相似性一般低于50%;针对GCRV进行流行病学的调查表明,除了有各基因型毒株的单独感染外,还存在不同基因型毒株之间的混合感染。因此,不同基因型新毒株的基因组解析及其快速诊断方法的建立,对于草鱼出血病的及早发现和有效防控具有重要的意义。本文从监测的湖北草鱼样本中发现一株健康草鱼携带的新型草鱼呼肠孤病毒,暂命名为HGCRV（healthy grass carp reovirus）。针对该毒株开展了细胞培养、电镜观察、理化性质分析、SDS-PAGE带型分析、全基因组测序和序列比对分析,并通过构建载体建立标准曲线,利用RT-q PCR分析了该病毒在鱼体不同组织和不同细胞系中的动态增殖情况。此外,我们还利用重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）结合胶体金试纸条建立了新毒株的可视化快速检测方法,本研究为草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学、遗传多样性分析以及草鱼出血病的快速诊断奠定了基础。主要研究结果如下:1.HGCRV毒株的分离鉴定及全基因组分析通过Illumina测序和RACE扩增技术,拼接得到该毒株的全基因组序列。结果表明:HGCRV的全基因组包含11个ds RNA,共编码12个蛋白。核苷酸总长度为23688 bp,G+C含量为57.2 mo1%,5’和3’末端具有保守基序（5’-GUUAUU……UCAUC-3’）。对其氨基酸分析表明,HGCRV与GCRV-873为代表的GCRV-I型毒株蛋白序列具有较高的同源性（69.57～96.71%）,而与GCRV-II型（GCRV-HZ08）和GCRV-III型（HGDRV）毒株的同源性相对较低,分别为22.65～45.85%和23.37～43.39%。基于Rd Rp蛋白的系统发育分析表明,HGCRV与水生呼肠孤病毒聚集在一个分支。并且该毒株与Aq RV-C种属亲缘关系较近,表明该毒株可能属于Aq RV-C。同时基于26株国内GCRV分离株VP6氨基酸序列构建的进化树显示,我国草鱼呼肠孤病毒毒株可明显的分为三个基因簇。相比于其他簇,HGCRV与GCRV-873株为代表的GCRV-I型分离株的关系更近,因此该分离株可能属于GCRV-Ⅰ型。2.HGCRV的体内体外增殖特性分析以102拷贝/μL的病毒稀释液分别接种于GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB细胞,结果显示:GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB五种细胞中均可以出现细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）。并且不同细胞对HGCRV的敏感性不同。根据其出现病变效应的时间,表明Gi CB和L8824细胞出现病变最早且最快。选取不同时间点的细胞收集样品对其定量分析表明,HGCRV在GCO、CIK、L8824、EPC和Gi CB细胞株中均能增殖,其中以L8824细胞和Gi CB细胞中的增殖量最高,病毒拷贝数可分别达到7.5×104拷贝/μL和6.4×104拷贝/μL。接种24h后,病毒在所有细胞中均开始明显增殖,其中在L8824、CIK和EPC细胞中,接种后72 h病毒增殖量达到最高,Gi CB和GCO细胞在接种后96 h病毒增殖量最高。HGCRV感染健康草鱼后,检测结果表明该病毒可以在其肝、肾、脾组织中增殖,且病毒拷贝数在肝、脾和肾脏组织中病毒RNA含量均表现出先升高后降低的趋势。在感染后3d,脾脏和肾脏中的病毒RNA含量达到最高,而肝脏在感染后4d达到峰值。3.针对HGCRV的RPA-LFD检测方法的建立针对HGCRV VP6基因片段设计RPA引物和探针,并对其反应条件进行优化,建立了针对HGCRV的RPA-LFD检测方法。温度优化结果表明,该方法的最佳反应温度为38℃。通过对该方法特异性检测,结果显示只有HGCRV检测出了阳性结果,而在GCRV-106、HGDRV、SVCV、Cre RV以及Cy HV-2等水生动物病毒样本和阴性模板样本中均未观察到阳性信号,表明该检测方法特异性较高。灵敏度分析表明,该方法的最低检测限为101copies/μL。选取102copies/μL和103copies/μL的质粒模板对其重复性验证,均可检出阳性信号,表明该检测方法的结果具有较高的可靠性。