恶臭假单胞菌KT2440是一株具有广泛代谢多样性和较强环境适应能力的非致病性革兰氏阴性菌,在生产应用实践中有重要的作用,如进行环境污染物的微生物修复及合成有特殊用途的化学产品。细菌形成生物被膜的能力和运动能力是菌株适应复杂环境的重要动力,也与工程菌株在生产实践中的应用效果紧密相关。研究和了解KT2440生物被膜和游动性的调控机理将有助于指导其在实际生产实践中的应用。环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）是细菌中广泛存在的核酸类第二信使,调控细胞内各种生理活动,尤其在调控细菌生物被膜和运动性之间转换中起着重要作用。恶臭假单胞菌KT2440中含有42个具有c-di-GMP合成/降解结构域的蛋白编码基因,截至目前只有4个基因已被报道了其酶活性及其对生物被膜与游动性的调控,剩余基因是否及如何影响生物被膜与游动性尚不清楚。在调控机理方面,c-di-GMP受体Fle Q响应胞内c-di-GMP水平,调控生物被膜基质组分编码基因的表达,进而影响生物被膜的形成。Fle N是假单胞菌中保守的鞭毛数目调控蛋白,常作为Fle Q的拮抗蛋白参与Fle Q所调控的生理过程。关于Fle N是否及如何调控KT2440中生物被膜的形成,以及其与Fle Q、c-di-GMP在生物被膜形成调控中的相互作用关系尚不清楚。本文重点探究了恶臭假单胞菌KT2440中42个c-di-GMP代谢酶在生物被膜形成和游动性中的作用,以及Fle N对生物被膜形成的调控机理。结果概括如下:1.KT2440中系统研究42个c-di-GMP代谢酶对细胞生物被膜与游动性的影响通过生物信息学比对发现KT2440中存在42个可能编码c-di-GMP合成/降解酶的基因,其中19个编码具有合成结构域（GGDEF）的蛋白,6个编码具有降解结构域（EAL或HD-GYP）的蛋白,17编码具有双重结构域（GGDEF+EAL）的蛋白。进一步分析发现42个c-di-GMP代谢酶中有37个与信号感应和信号转导结构域相偶联,暗示这些c-di-GMP代谢酶可能与外界环境信号响应有关。为了探究恶臭假单胞菌KT2440中42个c-di-GMP代谢酶在生物被膜形成和游动性中的作用,我们系统构建了42个c-di-GMP代谢酶编码基因缺失和超表达突变体,并检测了缺失和超表达突变体菌株中的生物被膜与游动性变化。结果显示,KT2440中仅仅有4个c-di-GMP代谢酶编码基因（PP＿0165,PP＿0218,PP＿0914和PP＿1494）缺失后显著影响生物被膜的形成。这四个基因中有三个以前有报道,而PP＿0218没有报道。PP＿0218是具有GGDEF和EAL双结构域的蛋白,缺失后显著抑制生物被膜的形成。而在超表达突变体中发现有17个基因超表达后显著影响生物被膜的形成。另外,就42个c-di-GMP代谢酶基因缺失或超表达突变体的游动性而言,绝大多数的c-di-GMP代谢酶编码基因缺失或超表达后都极显著的影响细胞的游动性,说明游动性相对于生物被膜的形成来说对细胞内c-di-GMP的浓度变化更加敏感。与此同时,我们还观察了42个超表达菌株中生物被膜相关基因（lap A和bcs）及鞭毛合成相关基因（fle SR和fli F）的基因表达变化。并概括比较了生物被膜和游动性表型与其相应基因表达之间的对应关系。从整体趋势上看,生物被膜形成能力强的菌株相对具有较弱的游动性,并且其细胞内生物膜相关基因表达上调而鞭毛形成相关基因表达下调。然而就个别菌株而言,存在表型与表型之间及表型与基因表达之间不完全吻合的现象。例如超表达PP＿0369,PP＿3581和PP＿3663后都显著影响生物被膜和游动性,然而却不影响细胞内生物被膜与鞭毛相关基因的表达。说明这些c-di-GMP代谢酶基因并非通过转录水平影响生物被膜的形成与游动性,还可能通过影响蛋白的翻译、蛋白的分泌或蛋白-蛋白之间的相互作用而最终影响细胞生物被膜的形成与游动性。本文的这部分结果为我们提供了关于42个c-di-GMP代谢酶基因调控细胞生物被膜形成和游动性的基本知识,并且也为我们提供了预测这些c-di-GMP代谢酶代谢活性的线索。这将为我们接下来进一步研究这些c-di-GMP代谢酶的功能及其调控奠定基础。2.恶臭假单胞菌KT2440中Fle N与Fle Q、c-di-GMP协同调控生物被膜编码基因lap A和bcs的表达之前研究结果证明Fle Q通过直接调控KT2440生物被膜编码基因lap A和bcs的表达而促进细胞生物被膜的形成。本研究发现Fle N与Fle Q协同作用调控lap A和bcs的表达而影响生物被膜的形成。研究表明,fle N缺失后,粘附蛋白编码基因lap A的表达下调,而胞外多糖编码基因bcs的表达上调。通过与fle Q突变体中lap A和bcs的表达相比发现,fle N与fle Q突变体中lap A和bcs的表达趋势一致。我们进一步通过体外EMSA实验研究发现,Fle N可以促进Fle Q与lap A和bcs的启动子结合,尤其在ATP存在作用下,Fle N对Fle Q的促进效果更加明显。与此同时,我们还观察了Fle N ATPase活性对Fle Q与lap A和bcs启动子结合的影响,发现Fle N ATPase ATP结合区发生点突变（21K-Q）后对Fle Q与lap A和bcs启动子结合的促进作用消失,说明Fle N ATPase ATP结合区在Fle N与Fle Q相互作用中起着至关重要的作用。除此之外,我们还观察了fle N突变体中c-di-GMP对生物被膜的影响。通过表型观察和转录分析发现,fle N的缺失严重削弱了c-di-GMP对生物被膜、菌落表面褶皱形态及lap A和bcs表达的影响,这一研究结果与c-di-GMP在fle Q突变体中的研究结果一致,说明c-di-GMP同时依赖Fle Q与Fle N调控KT2440生物被膜的形成。本文初步探究了42个c-di-GMP代谢酶在生物被膜与游动性调控中的作用,并确定了Fle N与Fle Q协同作用调控KT2440生物被膜形成的机制。本文的结果为我们以后更深的研究c-di-GMP及其代谢酶的功能提供了线索。