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甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌是最常见的病理类型。目前对甲状腺乳头状癌发生发展的机制研究尚未取得突破性进展。MIAT是一种常见的长链非编码RNA，在多种恶性肿瘤中高表达，并已证实在肿瘤调控中发挥重要作用，研究发现在非小细胞肺癌中，抑制MIAT的表达可以充分降低肿瘤细胞的侵袭能力，并且MIAT表达水平的高低与肿瘤大小呈正相关。我们从GEO公共数据库发现MIAT在甲状腺乳头状癌组织存在一定程度的表达。然而目前在甲状腺癌的基因分析研究中，对MIAT的研究却鲜有报道，关于其具体的细胞通路机制尚无详细的报道。
p21是最常见的抑癌基因，可以通过对细胞周期的阻滞来减少受损DNA的复制从而抑制癌细胞增殖。而最近的研究发现p21在正常甲状腺组织中表达很低，但在甲状腺恶性肿瘤中表达升高，p21在甲状腺癌组织中的表达与原发肿瘤大小及肿瘤侵犯有关，在较大的肿瘤或者侵犯包膜的甲状腺乳头状癌中表达更高，推测p21在甲状腺癌中的促癌性，但是其具体机制尚需要进一步验证。
GSK-3β/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的关键部分，该通路的异常激活可能会多方面促进疾病的发生及发展过程，进而导致机体细胞的异常分化、增殖以及凋亡等诸多病理过程。目前，GSK-3β/β-catenin信号通路在机体不同状态下的转导途径以及相应的调控机制等已经成为医学界一大研究热点，同时也成为了治疗相关恶性肿瘤病变的潜在靶点。
目的：
基于上述基础，本课题拟研究MIAT在甲状腺乳头状癌的作用，从而为甲状腺乳头状癌的发生发展提出新机制，以期为临床上甲状腺癌的诊断、治疗及评判预后提供新的思路。我们通过体外及体内两个方面研究，探讨MIAT对甲状腺乳头状癌生物学行为的调控作用，推测MIAT可能通过调控p21基因发挥作用并进一步研究，探讨MIAT调控p21通过靶向GSK-3β/β-catenin信号通路的作用机制。
方法：
（一）体外研究
首先，我们在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中选取人甲状腺癌基因表达芯片GSE3467，采用R语言筛选甲状腺乳头状癌和正常人群的差异表达基因；选取郑州大学第一附属医院甲状腺外科2016.03~2017.03期间行手术治疗的甲状腺乳头状癌新鲜标本共24例。所有患者均为初次治疗，未接受过放疗及化疗，不合并甲亢、桥本氏甲状腺炎等自身免疫性疾病。所有甲状腺乳头状癌组织标本于手术切除后30分钟内放入液氮，并放置于-80℃冰箱保存。所有标本均通过冰冻切片后染色，经由本院病理科医生确诊为甲状腺乳头状癌。在显微镜下，甲状腺癌组织中90%以上细胞为肿瘤细胞，无坏死组织。随后提取癌细胞作为研究对象，其中8例作为对照组(control组，未做任何处理)，8例作为研究I组（I-MIAT组，MIAT的表达质粒pCMV-MIAT转染到研究组甲状腺乳头状癌组织细胞中），8例作为研究II组（R-MIAT组，设计siRNA序列沉默MIAT在甲状腺乳头状癌细胞中的表达）；同时在I-MIAT及Control组中分别选取部分细胞加入p21抑制剂对p21的表达进行阻断,将其分别设置成I-MIAT-b及Control-b组，本研究所有实验方案均经郑州大学第一附属医院伦理委员会审批同意。具体检测项目如下：
（1）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞中MIAT表达含量，对其差异性进行评估。
（2）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞中p21基因的具体表达情况，对其差异性进行评估。
（3）流式细胞技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞凋亡情况。
（4）CCK-8实验检测各组细胞的增殖情况。
（5）Transwell法测定细胞侵袭和迁移能力。
（6）流式细胞仪检测细胞周期变化。
（二）体内研究
选取实SPF级别BABL/c裸鼠60只作为研究对象，构建裸鼠皮下甲状腺乳头状癌移植瘤模型，将其分成以下五组，Control组（不做任何处理）、I-MIAT组（裸鼠瘤体内注射MIAT表达质粒pCMV-MIAT）、R-MIAT组（裸鼠瘤体内注射MIAT shRNA）、I-MIAT-b组（裸鼠瘤体内注射MIAT表达质粒pCMV-MIAT及尾静脉注射p21抑制剂）、Control-b组（裸鼠尾静脉注射p21抑制剂），裸鼠继续培养两周后处死，取其肿瘤组织，进行相关项目分析。
（1）裸鼠成活率及瘤体大小分析；
（2）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织中MIAT及p21表达含量，对其差异性进行评估。
（3）划痕实验检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞迁徙情况。
（4）免疫荧光化学分析各组甲状腺乳头状癌组织细胞中p21蛋白、GSK-3β及β-catenin蛋白表达。
结果：
（一）体外研究：
（1）差异表达基因分析：基因差异表达值被计算，当差异值大于2，并且变异系数大于平均变异系数，甲状腺乳头状癌与正常组织相比一共有7800个基因发生了差异表达，MIAT在甲状腺乳头状癌中高表达，差异具有统计学意义。
（2）qPCR检测：MIAT在I-MIAT组表达最高，在R-MIAT组表达显著低于其余两组，当p21拮抗剂加入后，各组MIAT的表达含量无明显变化，，P＜0.05,差异具有统计学意义；p21在I-MIAT组表达高于对照组和R-MIAT组，加入p21抑制剂后，其表达含量出现不同程度下降，P＜0.05，数据差异具有统计学意义。
（3）细胞凋亡检测：随着MIAT表达增加，细胞的凋亡率逐渐降低。在p21被抑制后，细胞的凋亡率呈现上升趋势，各组之间的细胞凋亡率统计分析为I-MIAT＜I-MIAT-b＜Control＜R-MIAT＜Control-b，各组数据比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（4）CCK-8检测细胞增殖：重点分析了各组甲状腺乳头状癌细胞在培养12小时、24小时、36小时及48小时后的细胞增殖情况。各组甲状腺乳头状癌细胞均体现出一定的增长趋势。在各个时间段，各组比较趋势均为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT，，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（5）细胞迁移和侵袭：I-MIAT组细胞的迁移及侵袭能力最强，当p21拮抗剂加入后，细胞的侵袭及迁移能力出现一定程度下降，各组之间细胞侵袭及迁移能力比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（6）细胞周期分析：I-MIAT组，细胞处于S期及G2/M期的细胞比例最高。p21抑制剂作用后，I-MIAT-b组较I-MIAT组相比，G1/G0期细胞的比例增高，同时S期及G2/M期细胞比例降低。R-MIAT组处于G1/G0期的细胞比例最高，同时S期及G2/M期细胞比例最低。，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（二）体内研究：
（1）裸鼠成活率：Control组、I-MIAT组、I-MIAT-b组、R-MIAT组及Control-b组的成活率分别为100%、91.67%、75.00%、83.33%及75.00%。
（2）活体荧光检测：Control-b组裸鼠出现肿瘤转移数为一只，侵袭部位较为单一；Control组及R-MIAT组裸鼠出现肿瘤转移数为两只，且侵袭部位依然较为单一，I-MIAT组出现6只裸鼠肿瘤转移现象；当p21被抑制后，裸鼠出现肿瘤转移的只数明显减少。各组裸鼠瘤体体积比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（3）qPCR：I-MIAT组p21的表达量最高。p21抑制剂加入后，p21表达含量降低，各组之间数据表达趋势为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（4）划痕实验：I-MIAT组瘤体细胞的迁移能力明显加强，p21抑制剂加入后，I-MIAT-b组瘤体细胞的迁移能力明显降低；R-MIAT组瘤体细胞的迁移能力进一步降低，各组瘤体细胞之间迁移能力比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
（1）过表达MIAT可提高甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭能力，细胞凋亡比例下降；沉默MIAT可降低甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭能力，提高了凋亡能力；
（2）MIAT可影响甲状腺乳头状癌细胞的周期分布，提高s期细胞比例，同时提升线粒体膜电位及ATP合成能力，使细胞处于高活性状态；
（3）MIAT可能通过靶向p21及GSK-3β/β-catenin信号通路调控甲状腺乳头状癌生物学功能。
p21是最常见的抑癌基因，可以通过对细胞周期的阻滞来减少受损DNA的复制从而抑制癌细胞增殖。而最近的研究发现p21在正常甲状腺组织中表达很低，但在甲状腺恶性肿瘤中表达升高，p21在甲状腺癌组织中的表达与原发肿瘤大小及肿瘤侵犯有关，在较大的肿瘤或者侵犯包膜的甲状腺乳头状癌中表达更高，推测p21在甲状腺癌中的促癌性，但是其具体机制尚需要进一步验证。
GSK-3β/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的关键部分，该通路的异常激活可能会多方面促进疾病的发生及发展过程，进而导致机体细胞的异常分化、增殖以及凋亡等诸多病理过程。目前，GSK-3β/β-catenin信号通路在机体不同状态下的转导途径以及相应的调控机制等已经成为医学界一大研究热点，同时也成为了治疗相关恶性肿瘤病变的潜在靶点。
目的：
基于上述基础，本课题拟研究MIAT在甲状腺乳头状癌的作用，从而为甲状腺乳头状癌的发生发展提出新机制，以期为临床上甲状腺癌的诊断、治疗及评判预后提供新的思路。我们通过体外及体内两个方面研究，探讨MIAT对甲状腺乳头状癌生物学行为的调控作用，推测MIAT可能通过调控p21基因发挥作用并进一步研究，探讨MIAT调控p21通过靶向GSK-3β/β-catenin信号通路的作用机制。
方法：
（一）体外研究
首先，我们在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中选取人甲状腺癌基因表达芯片GSE3467，采用R语言筛选甲状腺乳头状癌和正常人群的差异表达基因；选取郑州大学第一附属医院甲状腺外科2016.03~2017.03期间行手术治疗的甲状腺乳头状癌新鲜标本共24例。所有患者均为初次治疗，未接受过放疗及化疗，不合并甲亢、桥本氏甲状腺炎等自身免疫性疾病。所有甲状腺乳头状癌组织标本于手术切除后30分钟内放入液氮，并放置于-80℃冰箱保存。所有标本均通过冰冻切片后染色，经由本院病理科医生确诊为甲状腺乳头状癌。在显微镜下，甲状腺癌组织中90%以上细胞为肿瘤细胞，无坏死组织。随后提取癌细胞作为研究对象，其中8例作为对照组(control组，未做任何处理)，8例作为研究I组（I-MIAT组，MIAT的表达质粒pCMV-MIAT转染到研究组甲状腺乳头状癌组织细胞中），8例作为研究II组（R-MIAT组，设计siRNA序列沉默MIAT在甲状腺乳头状癌细胞中的表达）；同时在I-MIAT及Control组中分别选取部分细胞加入p21抑制剂对p21的表达进行阻断,将其分别设置成I-MIAT-b及Control-b组，本研究所有实验方案均经郑州大学第一附属医院伦理委员会审批同意。具体检测项目如下：
（1）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞中MIAT表达含量，对其差异性进行评估。
（2）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞中p21基因的具体表达情况，对其差异性进行评估。
（3）流式细胞技术检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞凋亡情况。
（4）CCK-8实验检测各组细胞的增殖情况。
（5）Transwell法测定细胞侵袭和迁移能力。
（6）流式细胞仪检测细胞周期变化。
（二）体内研究
选取实SPF级别BABL/c裸鼠60只作为研究对象，构建裸鼠皮下甲状腺乳头状癌移植瘤模型，将其分成以下五组，Control组（不做任何处理）、I-MIAT组（裸鼠瘤体内注射MIAT表达质粒pCMV-MIAT）、R-MIAT组（裸鼠瘤体内注射MIAT shRNA）、I-MIAT-b组（裸鼠瘤体内注射MIAT表达质粒pCMV-MIAT及尾静脉注射p21抑制剂）、Control-b组（裸鼠尾静脉注射p21抑制剂），裸鼠继续培养两周后处死，取其肿瘤组织，进行相关项目分析。
（1）裸鼠成活率及瘤体大小分析；
（2）采用q-PCR技术检测各组甲状腺乳头状癌组织中MIAT及p21表达含量，对其差异性进行评估。
（3）划痕实验检测各组甲状腺乳头状癌组织细胞迁徙情况。
（4）免疫荧光化学分析各组甲状腺乳头状癌组织细胞中p21蛋白、GSK-3β及β-catenin蛋白表达。
结果：
（一）体外研究：
（1）差异表达基因分析：基因差异表达值被计算，当差异值大于2，并且变异系数大于平均变异系数，甲状腺乳头状癌与正常组织相比一共有7800个基因发生了差异表达，MIAT在甲状腺乳头状癌中高表达，差异具有统计学意义。
（2）qPCR检测：MIAT在I-MIAT组表达最高，在R-MIAT组表达显著低于其余两组，当p21拮抗剂加入后，各组MIAT的表达含量无明显变化，，P＜0.05,差异具有统计学意义；p21在I-MIAT组表达高于对照组和R-MIAT组，加入p21抑制剂后，其表达含量出现不同程度下降，P＜0.05，数据差异具有统计学意义。
（3）细胞凋亡检测：随着MIAT表达增加，细胞的凋亡率逐渐降低。在p21被抑制后，细胞的凋亡率呈现上升趋势，各组之间的细胞凋亡率统计分析为I-MIAT＜I-MIAT-b＜Control＜R-MIAT＜Control-b，各组数据比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（4）CCK-8检测细胞增殖：重点分析了各组甲状腺乳头状癌细胞在培养12小时、24小时、36小时及48小时后的细胞增殖情况。各组甲状腺乳头状癌细胞均体现出一定的增长趋势。在各个时间段，各组比较趋势均为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT，，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（5）细胞迁移和侵袭：I-MIAT组细胞的迁移及侵袭能力最强，当p21拮抗剂加入后，细胞的侵袭及迁移能力出现一定程度下降，各组之间细胞侵袭及迁移能力比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（6）细胞周期分析：I-MIAT组，细胞处于S期及G2/M期的细胞比例最高。p21抑制剂作用后，I-MIAT-b组较I-MIAT组相比，G1/G0期细胞的比例增高，同时S期及G2/M期细胞比例降低。R-MIAT组处于G1/G0期的细胞比例最高，同时S期及G2/M期细胞比例最低。，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（二）体内研究：
（1）裸鼠成活率：Control组、I-MIAT组、I-MIAT-b组、R-MIAT组及Control-b组的成活率分别为100%、91.67%、75.00%、83.33%及75.00%。
（2）活体荧光检测：Control-b组裸鼠出现肿瘤转移数为一只，侵袭部位较为单一；Control组及R-MIAT组裸鼠出现肿瘤转移数为两只，且侵袭部位依然较为单一，I-MIAT组出现6只裸鼠肿瘤转移现象；当p21被抑制后，裸鼠出现肿瘤转移的只数明显减少。各组裸鼠瘤体体积比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（3）qPCR：I-MIAT组p21的表达量最高。p21抑制剂加入后，p21表达含量降低，各组之间数据表达趋势为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
（4）划痕实验：I-MIAT组瘤体细胞的迁移能力明显加强，p21抑制剂加入后，I-MIAT-b组瘤体细胞的迁移能力明显降低；R-MIAT组瘤体细胞的迁移能力进一步降低，各组瘤体细胞之间迁移能力比较为Control-b＜R-MIAT＜Control＜I-MIAT-b＜I-MIAT,，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
（1）过表达MIAT可提高甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭能力，细胞凋亡比例下降；沉默MIAT可降低甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭能力，提高了凋亡能力；
（2）MIAT可影响甲状腺乳头状癌细胞的周期分布，提高s期细胞比例，同时提升线粒体膜电位及ATP合成能力，使细胞处于高活性状态；
（3）MIAT可能通过靶向p21及GSK-3β/β-catenin信号通路调控甲状腺乳头状癌生物学功能。