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近年来,环境内分泌干扰物质(Endocrinedisruptingchemicals,EDCs)对人类和野生生物的危害越来越受到人们的关注。这些物质通过模拟或拮抗干扰生物体内源激素的形成或功能,由此影响生物体生长、发育、繁衍等生命活动。已有报道造纸废水对环境造成了严重的污染,引起生活于其中的鱼类生理生化上一系列的变化,如致使鱼类形态上发生改变、免疫改变、繁殖损伤、干扰肝脏的正常功能,并影响肝脏中酶的活力和性激素的产生。我国是世界造纸大国,但目前对造纸废水引起的内分泌干扰效应及生态毒理效应等方面的研究尚处于初步阶段。
本文以珠江三角洲地区四会邓村河为研究对象,利用食蚊鱼(Gambusiaaffinis)作为指示生物,采用生物分析法(体外及体内)和化学分析法(LC/MS/MS)对广东四会邓村造纸废水中的内分泌干扰物进行检测和研究。此外,使用食蚊鱼活体暴露试验对野外研究结果进行了室内模拟,利用造纸废水疑致雄性化的目标化合物雄烯二酮(AED)进行为期180天的暴露实验,开展环境激素作用机理和剂量.效应关系研究,尝试建立雄激素暴露生态毒理学研究方法体系,寻找水环境污染的早期预警的生物标志物,为环境激素的生态和健康风险评价提供科学依据和技术支持。本文主要结果研究如下:
1、对邓村造纸废水中生活的食蚊鱼进行调查,研究造纸废水对食蚊鱼的种群构成(性别比例和年龄组成)、生长发育(体长、体重、肝腺指数和性腺指数)、生殖力(雄鱼精子数量、精子活力、雌鱼繁殖体数和平均卵重)和组织形态学结构等相关的生长发育状况。结果表明,与对照点相比,造纸废水中各采样点的食蚊鱼性别比例和年龄结构出现失衡,雄性食蚊鱼的比例较大,同时雄鱼精子数量增多,雌鱼性腺中繁殖体数目和平均卵重量下降。雌性食蚊鱼体长体重明显下降,肝腺指数和性腺指数下降。组织切片观察发现,造纸废水暴露损伤食蚊鱼肝脏细胞结构,使肝脏细胞出现空泡、坏死、细胞肿大、胞质疏松等病理变化;并破坏食蚊鱼卵巢结构,抑制卵巢生长,影响其生殖能力,具有生殖毒性。
2、利用实验鱼脊椎骨和臀鳍形态学变化特征,调查了生活在邓村河中的雌/雄性食蚊鱼受内分泌干扰现状。结果显示,排入造纸废水河流各采样点采集的雌鱼较之在参照点的雌鱼,其臀鳍第3鳍条的分节数明显增多(P＜0.05),第4:6鳍条比率明显增大(P＜0.05)。采用食蚊鱼第14、15和16椎肋骨的L、P、D值来研究雌性食蚊鱼受雄性化影响的程度。结果表明,造纸废水中各采样点雌性食蚊鱼的第14、15和16椎肋骨P、D值均显著升高,雌性食蚊鱼出现雄性食蚊鱼的第二性征。
3、对造纸废水中生活的食蚊鱼肝脏的7-乙氧基-3-异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性进行监测,研究造纸废水对食蚊鱼生物转化系统的影响。结果表明,无论春季和夏季,造纸废水中各采样点的食蚊鱼EROD活性均比对照点显著升高,GST活性则呈现出不一致的响应。由此可见,EROD可作为造纸废水污染的敏感的分子标志物,而GST作为其分子标志物则不是很敏感。EROD活性的改变从分子水平上反映了污染物对鱼体肝细胞的损伤,造成内分泌系统的干扰危害,引起一系列的生理生化反应。
4、采用半定量PCR技术,以卵黄蛋白原基因(VTGα)、雄激素受体基因(Arα)的mENA转录水平为指标,从分子水平上调查了生活在邓村河中的雌/雄性食蚊鱼受内分泌干扰的现状。结果显示,与对照点相比,造纸废水各采样点采集的雄鱼肝脏VTGαmRNA和雌鱼臀鳍的ArαmRNA转录水平较之对照点的有显著升高(P＜0.05)。
5、利用固相萃取技术结合重组基因酵母技术检测了各采样点废水的体外内分泌干扰效应(雌激素效应、抗雌激素效应和雄激素效应),测得雌激素当量EEQ值为13.27ng/L～20.03ng/LE2之间,抗激素当量TEQ为27.61ng/L～138.54ng/LTAM,雄激素当量DEQ值介于3.92ng/L～6.52ng/LDHT。结果显示,造纸废水具有雌激素效应、抗雌激素效应和雄激素效应,其中,抗雌激素效应最为强烈。
6、使用液相色谱.串联质谱(LC/MS/MS)检测6种雌激素类物质和14种雄激素类物质的含量。结果显示,雌激素类物质中雌酮(estrone,E1)、雄激素类物质中1,4雄烯二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione,ADD)、雄烯二酮(4-androstene-3,17-dione,AED)、炔诺孕酮(norgestrel)、睾酮(testosterone)、反式雄酮(epi-androsterone)、孕酮(progesterone)、17α-勃酮(17α-boldenone)、17β-勃酮(17β-boldenone)、雄酮(androsterone)、羟甲雄烷吡唑(stanozolol)均有检出。E1在引起食蚊鱼雌激素效应中起到重要作用;ADD、AED和Androsterone则在引起食蚊鱼雄激素效应中起到重要作用。
7、以食蚊鱼为模式生物,对造纸废水中疑致雄激素作用的化合物雄烯二酮(AED)展开环境激素作用机理和剂量.效应关系研究。结果表明,AED可引起成熟的雌性食蚊鱼臀鳍延长,臀鳍长度的变化与AED暴露的浓度呈明显的浓度剂量效应。AED对食蚊鱼的性腺和肝脏造成损伤,卵母细胞出现不同程度的抑制,肝细胞脂质化。对食蚊鱼的幼鱼进行暴露实验发现,AED暴露组的雄/雌比率较高,雌性幼鱼的Ray4/Ray6与暴露浓度呈明显的浓度-剂量关系,最低浓度组0.14nM也对雌性幼鱼造成影响。雌性食蚊鱼肝腺指数和性腺指数下降。组织切片观察发现,AED损伤食蚊鱼幼鱼肝脏细胞结构,肝脏细胞出现空泡化;并破坏食蚊鱼卵巢组织结构,组织切片中出现大量发育停滞的卵母细胞。
8、对AED暴露下食蚊鱼肝脏7-乙氧基-3-异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性进行评价。结果表明,AED对上述各酶系产生一定的干扰,EROD活性显著降低,各浓度组的GST活性呈现非单调剂量效应关系。