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背景:虫媒病毒(Arbovirus)是一种通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物和人类造成传播的病毒,蚊虫、蜱虫、蠓虫、白蛉、虻、螨等500余种吸血节肢动物均可作为虫媒病毒的传播媒介。中国西北地区从地理区划上来说包括:陕西省、甘肃省、青海省、宁夏回族自治区和新疆维吾尔自治区这五个省和自治区。与我国其他地区相比,西北深入我国内陆腹地,延绵的高原和山区使得西北地区地形相对“闭塞”,距海岸线较远,导致本地区形成夏季高温少雨、冬季严寒干燥的典型大陆性气候特征,温差较大,荒漠、草原和戈壁滩广布,人烟稀少,本地区农业以灌溉农业畜牧业为主。这使西北地区在气候、地理、生境和物种等方面具有独特性,蚊虫媒介种类较多,与内地差异明显。近年来,在西北地区进行的虫媒病毒调查中分离到乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、Tahyna病毒等多种蚊传虫媒病毒,流行病学研究显示在夏秋季节蚊虫活动达到顶峰时,该地区存在由不明原因病原体造成的发热及病毒性脑炎的流行,此外,青海和新疆是我国的两个非乙脑疫区,新疆到目前为止还尚未发现过乙脑病毒的流行,以上信息表明,西北地区的蚊虫分布和当地所流行的虫媒病毒及其相关疾病可能与我国其他地区大不相同。目的:对西北地区的蚊虫进行系统调查以了解我国西北不同地区蚊虫分布特征及差异特点;建立与西尼罗病毒关系密切的Koutango病毒的快速检测方法,提高我国对外来病毒病的发现和预警能力;对西北地区可能传播的乙脑、西尼罗病毒等重要虫媒病毒进行筛查,提供有关该地区蚊传虫媒病毒分布的基本信息,并为相关病原体的检测、监测及研究提供理论支撑。方法:1、我国西北地区在夏秋季的6-9月相对温度较高,此时蚊虫活动较为活跃。2018年8月-9月在新疆、甘肃和宁夏3个省(自治区)采集蚊虫标本;2019年6月-9月在陕甘宁和青海、新疆5个省(自治区)采集蚊虫标本。采集时间为下午5:00至次日早上7:00。2、从GenBank中下载Koutango病毒全部的基因序列,经序列分析后针对Koutango病毒中高保守的NS5区段设计特异性引物与探针,使用体外转录后的RNA标准品建立了 Koutango病毒基因拷贝数的绝对定量分析模型,通过4科9种虫媒病毒及平行重复实验验证检测方法的特异性和稳定性。3、将西北地区2018-2019年采集的1469批蚊虫标本进行研磨并提取核酸,使用TaqMan real-time RT-PCR等检测方法对乙脑病毒、西尼罗病毒、Tahyna病毒、Koutango病毒、寨卡病毒等5种重要蚊传虫媒病毒进行筛查;将新疆喀什地区采集的132批蚊虫标本通过细胞培养法进行病毒分离。4、使用普通PCR或二代测序获得病毒基因组序列,新分离病毒用ClustalX2.0和BioEdit等生物学软件对序列比对后鉴定,进行同源性和差异性分析比较并构建系统进化树,通过电子显微镜方法对病毒进行形态学研究。结果:1、2018-2019年在西北地区5个省(自治区)的27个市县区,累计56个采集点先后采集120次,共采集包括三带喙库蚊、淡色库蚊、致倦库蚊、尖音库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊和伊蚊属在内的4属7种75,099只蚊虫标本。2018年的夏季宁夏和甘肃爆发了乙脑疫情,西北5省(自治区)中,在宁夏回族自治区相对其它地区现场采集的时间最长、次数最多,蚊虫数量也相对最多,占蚊虫采集总数的50.35%;蚊虫采集的时间主要集中于7、8月份,其中采集三带喙库蚊数量最多,占采集总数的42.09%。2、建立KOUTV TaqMan real-time RT-PCR的检测方法,基于NS5基因片段设计引物和TaqMan探针,与其它9种虫媒病毒均无交叉反应,方法特异性较高;样品重复检测的变异系数(CV值)均小于1.5%;定量分析灵敏度达到1.0×102拷贝/反应。通过建立的快速检测方法对新疆维吾尔自治区2019年采集的112批(6328只)蚊虫样本进行了检测,结果均为阴性。3、西北地区2018-2019年采集的蚊虫标本进行研磨,使用TaqMan real-time RT-PCR方法对5种重要蚊传虫媒病毒进行筛查,累计检测5988批次,结果有36批JEV检测阳性(阳性率为2.45%);5批TAHV检测阳性(阳性率为0.34%);WNV和ZIKA检测结果均为阴性。新测定了 11个JEV E基因序列,系统进化分析显示11株JEV亲缘关系较近,且均属于基因I型,该结果与TaqMan real-time RT-PCR法的分型检测结果一致。4、对2018-2019年新疆维吾尔自治区喀什地区采集的132批蚊虫标本使用细胞培养法分离病毒,得到1株NDiV-XJ1968,系统进化分析显示该分离株与其他地区的NDiV未在同一进化分支中,全基因组氨基酸和核苷酸序列分析表明与我国其他分离株的亲缘关系较远,同源性为93.8%-94.1%,这是NDiV在新疆的首次分离鉴定。结论:本研究首次在宁夏的蚊虫中检测到JEV核酸,提示宁夏自然界中存在乙脑病毒循环,西北地区目前自然界中蚊虫所携带的乙脑病毒主要为GI型,西北地区乙脑防控的重点在陕甘宁地区,三带喙库蚊是西北地区携带乙脑病毒的主要蚊种。首次从宁夏的库蚊中检测到TAHV核酸,表明在我国除现已分离到TAHV的新疆、青海和内蒙古之外,宁夏的库蚊中也可能有该病毒的存在;从新疆的蚊虫标本中再次检测到TAHV核酸,表明伽师县的库蚊中仍存在TAHV的循环。首次在我国新疆分离鉴定了 NDiV,并从分子进化特征和形态学等方面对病毒进行了分析,丰富了我国蚊传虫媒病毒的基线数据,为西北地区不明原因疫情的分析及蚊传虫媒病毒相关疾病的控制提供客观依据。建立了与西尼罗病毒关系密切的Koutango病毒的快速检测方法,特异性强,敏感度高。