论文部分内容阅读
目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,靶向下调膀胱癌T24细胞的VEGF(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,观察下调膀胱癌T24细胞VEGF表达后对外周血来源的DC(dendritic cell,DC)前体细胞分化成熟的影响。利用膀胱癌T24细胞的全抗原制备DC疫苗进行体外细胞实验研究,观察下调VEGF后的DC疫苗介导的特异性T淋巴细胞对膀胱癌T24细胞的杀伤作用。方法:利用RNAi技术,以慢病毒为载体,构建LV-VEGFA-RNAi,转染膀胱癌T24细胞,下调膀胱癌T24细胞的VEGF表达。转染实验分为3组:转染组(LV-VEGF)、阴性转染组(LV-CO)及未转染组(CO)。用倒置显微镜及荧光显微镜观察各组细胞生长及荧光表达情况。利用q RT-PCR以及ELISA检测各组膀胱癌T24细胞VEGF的m RNA和蛋白表达水平。制备三组DC疫苗:对照组(常规完全培养液)、干扰组(25%体积分数的转染组培养上清)以及未干扰组(25%体积分数的未转染组培养上清)。在体外利用rh IL-4(recombinant human interleukin-4,rh IL-4),rh GM-CSF(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rh GM-CSF)诱导DC分化,第8天各组加入膀胱癌T24细胞全抗原,2h后加入LPS(Lipopolysaccharides,LPS)刺激DC成熟。继续培养至第14天,通过倒置显微镜观察DC形态,流式细胞技术鉴定DC表型:CD1a、CD83、CD86。利用尼龙毛柱法从人外周血中分离出T淋巴细胞,进一步用流式细胞技术鉴定CD3+T淋巴细胞。利用MTT法检测各组DC疫苗刺激T淋巴细胞增殖及活化的T淋巴细胞的细胞毒性,同时收集上清液,ELISA法检测IL-10、IL-12及IFN-γ水平。收集、整理实验数据,用SPSS17.0进行统计学分析。结果:以慢病毒为载体的RNAi序列成功下调膀胱癌T24细胞VEGF的表达,与未转染组相比,转染组膀胱癌T24细胞VEGF的m RNA及蛋白表达水平下降(P<0.05),阴性转染组与未转染组相比,二者无差别(P>0.05)。三组DC疫苗经流式细胞技术检测细胞表型,与对照组相比,干扰组、未干扰组DC表面分子CD1a、CD83、CD86表达均有不同程度下降(P<0.05);与未干扰组比较,干扰组DC表面分子CD1a、CD83、CD86表达均上调(P<0.05)。三组DC分泌IL-10、IL-12存在差异(P<0.05),与对照组相比,干扰组与未干扰组培养上清中IL-12含量有不同程度下降,而IL-10含量存在不同程度的升高。各组DC体外对自体T淋巴细胞刺激能力不同(P<0.001),对照组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力(SI:10.90±0.49)最强,未干扰组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力(SI:8.03±0.39)最弱,与未干扰组相比,干扰组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力(SI:8.81±0.41)增强(P<0.001)。各组DC激活T淋巴细胞的得到的CTL对T24靶细胞的杀伤存不同,干扰组(46.23±1.07)%、未干扰组(32.50±0.38)%与对照组(54.64±0.90)%杀伤率存在差异(P<0.001),对照组DC刺激形成的CTL细胞杀伤T24细胞的能力最强,未干扰组DC刺激形成的CTL杀伤T24细胞的能力最弱,干扰组CTL杀伤T24细胞的能力比未干扰组更强(P<0.001)。三组负载抗原的DC活化T淋巴细胞后分泌的IFN-γ量不全相同,干扰组(37.45±0.38)pg/ml、未干扰组(21.87±0.30)pg/ml与对照组(51.08±0.41)pg/ml之间存在差异,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:膀胱癌T24细胞分泌的VEGF在体外抑制DC的分化成熟,进一步抑制了DC介导的细胞免疫。体外抑制肿瘤VEGF的表达,有利于增强DC疫苗介导的CTL对膀胱癌T24细胞的杀伤效应。