目的：骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干细胞之外的另一类干细胞。它具有极高的横向分化和复制能力，在不同诱导条件下具有多向分化潜能。目前常用于培养骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓培养法和密度梯度分离法。前者简单易行，将骨髓全部接种，利用干细胞贴壁时间短，通过换液达到分离、纯化的目的；后者是将淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞接种。目前尚无一种标志物能作为MSCs的身份特征，国际上通常采用多种CD分子的组合综合界定。MSCs是正常造血功能赖以存在和发挥功能的必要支持，因而在再生医学领域中有着广泛的应用前景。本实验以小鼠骨髓为MSC来源，旨在摸索有效、可行的骨髓间充质干细胞的分离、培养方法，对所培养的BMMSC进行鉴定，并检测这种培养法的产率。 临床上恶性血液病患者经反复放、化疗，常出现骨髓造血恢复延迟，有较长时间的低细胞期。研究表明：骨髓恢复延迟可能与骨髓基质损伤有关。BMMSC是骨髓基质的组成之一，故我们利用小鼠研究BMMSC损伤时的分离、培养，并观察此时小鼠BMMSC的状况，为临床治疗方面提供新的思路。 方法： 1、动物：选用清洁级4～6周龄BALB/c(H-2)小鼠(雌雄各半)为骨髓细胞来源。清洁级4～6周龄DBA/2(H-2)小鼠(雌雄各半)为免疫细胞来源，饲养于无菌层流柜中。 2、MSC的分离和培养 全骨髓培养贴壁筛选法：将BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，超净台内无菌分离小鼠股骨及胫骨，以CCM(完全培养基，为F12-DMEM培养液，含青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)冲洗骨髓腔，轻柔吹打冲洗液，制成单细胞悬液，直接接种于25cm<2>一次性无菌塑料培养瓶中，为P0(Passage 0)代。每瓶培养基体积补足至5ml。细胞终浓度约为1×10<8>/L，37℃，5％CO<,2>饱和湿度培养。所用小鼠只数与接种瓶数比例为1∶1。 密度梯度离心法：以同上方法获得骨髓细胞，离心，用CCM重悬沉淀，缓慢加于Ficoll分离液(p=1.077g/ml)上，常温离心(1500rpm，15min)，吸取界面层细胞，无菌PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，以CCM调整细胞浓度至7～8×10<6>L培养为PO’代。培养及传代条件同前。 全骨髓培养贴壁筛选法72小时首次全量换液；密度梯度离心法72小时首次半量换液。此后根据细胞生长状态、培养基颜色等客观条件，约每2～3天适时换液。细胞逐渐贴壁、融合。当细胞生长达到80～90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化、传代。第一代为P1，第二代为P2，以此类推。 每种方法组种植5瓶细胞，分别选取两组生长好的不同代细胞，MTT法测定细胞活力，绘制生长曲线。 3、MSC的鉴定 3．1倒置显微镜下直接观察活体细胞形态，适时留取照片； 3．2选取不同代数的MSC制作细胞爬片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察细胞形态及不同传代数对其影响； 3．3选取抗鼠CD34、CD414、CD45三种单抗，用流式细胞仪进行MSCs细胞免疫表型测定； 3．4诱导分化 3．4．1成骨分化诱导体系：地塞米松(10<-7>mol/L)、β-甘油磷酸钠(10mmol/L)、维生素C(50mg/L)，以CCM为溶剂，诱导培养。倒置显微镜下观察，待细胞形态发生改变，可见钙化结节时，ALP染色，证实分化效果。 3．4．2成脂分化诱导体系：地塞米松1μmol/L、胰岛素10mg/L，以CCM为溶剂，诱导培养。倒置显微镜下观察，待细胞形态发生改变，出现脂肪空泡时，油红O染色，证实分化效果。 4、免疫介导再障模型小鼠的构建，分三组进行： 单纯照射组：BALB/c小鼠，lO只，雌雄各半，<60>Co γ射线8Gy照射。 脾细胞组：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<60>Coγ射线8Gy照射后4h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠脾脏的单细胞悬液0.2ml(细胞数为1×10<6>)。 假照射组(对照组)：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<60>Coγ射线8Gy照射时以铅砖屏蔽，照射后4h内由尾静脉输入0.2ml生理盐水。 三组均于第7、15、30天行血常规检查。 5、选取血象最低时及血象恢复后的存活小鼠，按第一部分中的全骨髓培养法，分离、培养小鼠BMMSCs，与来源于正常小鼠的BMMSC作对照。每日在倒置显微镜下观察活体细胞形态，适时留取照片。MTT法绘制生长曲线。 6、统计学分析：血常规数据用均数±标准差表示，t检验各组间差异，方差不齐者改用非参数检验，取α=0.05。结果1在我实验室条件下，全骨髓培养贴壁筛选法及梯度密度离心法均能成功地培养出BMMSCs。原代细胞生长曲线显示前者细胞贴壁早，生长快，更早达到传代规模。与后者比较有显著差异。达到传代规模时的培养天数均数为D<,P0>∶D<,P0>=9.6±1.14：14.2±1.48(p<0.05)。 MTT法测定细胞活力(贴壁率)：P0/P0’细胞第1～2天变化不大，可能为细胞生长的潜伏适应期；第3天后贴壁显著增加，提示细胞进入对数生长期；第6天起增长缓慢，进入平台期。从P2开始，传代间隔逐渐缩短(P0要约14天，P1约10天，P2约1周，P3约3～4天)。从P4起，约消化传代第2天，细胞就可以贴壁达到60～70％的融合。 2．MSC形态学观察：急性分离的小鼠骨髓细胞接种4小时后，部分细胞贴壁，呈圆形。24小时后呈纺锤形、梭形、多角形等，形态多样，部分细胞形成集落，增殖迅速，集落之间相互靠近。达80～90％融合时细胞形态不规则，有梭形、星形、多角形等。胞体肥大，胞质丰富。P3以后，融合后的细胞呈旋涡状，细胞形态较前均一。 瑞-吉染色MSC形态观察：P0～P2时，MSCs高倍镜下细胞呈梭形、星形、多角形等，胞体肥大，胞质丰富，有细长、分叉的突足，细胞核大而疏松，核仁明显，可见到处于分裂相的核仁。P3以后细胞形态逐渐趋向均一，呈成纤维样集落状生长并相互融合。P7以后逐渐出现“旋涡”样集落，细胞密度极大。 流式细胞学分析各期MSCs表面抗原：P0表面抗原表达谱为9.03％CD34，1.86％CD44，100％CD45，P3表面抗原表达谱为0.04％CD34，97.37％CD44，4.29％CD45。多向分化：成脂肪细胞及成骨细胞诱导体系可以诱导P3及以后的培养细胞分别分化为具有脂肪细胞和成骨细胞特点的细胞。 3脾细胞组小鼠于照射后第8天起陆续出现皮毛散乱、体重下降、苍白萎靡。外周血象于照射后开始下降，持续减低15天以上。第7天白细胞水平达到最低点，显著低于正常。单纯照射组小鼠血象在第15天已开始恢复。假照射组小鼠无上述变化。 脾细胞组第7、15天的小鼠骨髓间充质干细胞培养，急性分离的骨髓单个核细胞计数明显低于正常对照组，细胞形态基本与对照组无明显区别。细胞接种后72小时后始有少量细胞贴壁，大部分细胞悬浮、死亡。贴壁细胞形态为圆形或多角形。生长曲线显示其生长明显慢于对照组。 镜下观察细胞形态发现与对照组相比，脾细胞组MSCs集落形成慢，数量少，细胞增殖缓慢。培养2周后，细胞融合不足50％，并且逐渐有细胞漂浮、死亡。培养3周，所剩细胞已不足20％，不能满足传代要求。脾细胞组第30天的小鼠骨髓间充质干细胞培养，与对照组相比，无明显差异。 结论 1、全骨髓培养贴壁筛选法较梯度密度离心法可以更有效地获取小鼠骨髓间充质干细胞： 2、P3～P12 MSCs具有表型均一的特点和多向分化能力； 3、两种方法所培养的细胞形态学、细胞表面免疫表型测定符合MSC特点，均有成脂、成骨等多向间质细胞分化能力； 4、免疫再障模型小鼠BMMSCs活性显著降低，体外细胞培养无法正常增殖、传代； 5、免疫介导的小鼠再障有自限性，骨髓造血功能经过骨髓抑制期后可自行恢复。恢复后的骨髓，间充质干细胞活性亦恢复，可支持正常造血。