肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见病、多发病,其死亡率在发达国家居第1位,在发展中国家居第2位,而且今年发病率仍呈上升趋势。因此,近40年来攻克肿瘤就一直是各国政府与科研、医疗机构的主要任务之一,其中化疗作为肿瘤四大常规治疗方法之一,已成为肿瘤治疗不可缺的手段。肿瘤化疗的根本目的是在保证患者安全的情况下以药物消灭肿瘤细胞,但是,由于恶性肿瘤细胞与正常细胞间缺少根本性的代谢差异,故目前临床上所有的抗肿瘤化疗药都不能完全避免对正常组织的损害,而且在多数情况下造成病人不得不因为这些损害而被迫停药。因此,如何提高肿瘤组织对化疗的敏感性,保护正常组织免受化疗的损害从而减轻毒副作用,是目前恶性肿瘤综合治疗研究的一个重要课题。近年分子肿瘤学、分子药理学、癌症细胞生物学的研究进展表明,癌症是一种至少由2种以上癌基因经多阶段变化所致的多基因疾病。这不仅为癌症的防治提供了不少新靶点、新领域,也使抗肿瘤药物研究从寻找传统的细胞毒性药物,逐渐转向针对肿瘤发病机制不同环节,寻找可具有多环节作用的新型抗肿瘤药物。因为目前认为,实体瘤的信号传导是一个复杂的、多因素的蛋白网络系统,抑制单一信号传导往往不足以遏制肿瘤的发展。而且多项临床试验也显示,多靶点抑制剂在治疗方面优于单靶点抑制剂,如ZD6474和COX2抑制剂可通过影响数个分子靶点而发挥防治肿瘤作用;COX2抑制剂与传统化疗药联用也可增强抗癌效果。既然多靶点抑制剂在治疗方面优于单靶点抑制剂,既然不同作用机制的化疗药联用可增强疗效也在于使它们各自的单靶点抑制形成了多靶点抑制,那末,我们就可以将疗效肯定、机制明确的常用化疗药,通过正交设计进行适当的配伍,并找到既可使它们通过作用于肿瘤信号传导的不同靶点而发挥协同抗肿瘤作用,又不表现各自的毒性的剂量,从而制备出新型多靶点复方抗肿瘤药物。这要比寻找新型多靶点作用的抗肿瘤药物容易得多。因此,有理由相信多靶点肿瘤信号传导抑制剂将在肿瘤治疗中扮演越来越重要的角色,两种或两种以上的化疗药物联合应用也将成为临床上越来越常用的化疗方案。多靶点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发的发展方向。本研究拟采用MTT法分别测定氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂（DDP）、吉西他滨（GEM）和长春瑞滨（VRB）四种已知化疗药物抑制小鼠肝癌H₂₂细胞生长的量效关系曲线,选取各药对H₂₂细胞抑制率小于30%的剂量进行不同的配伍,观察5-FU、DDP、GEM和VRB不同药物和剂量配伍对小鼠肝癌H₂₂细胞生长的抑制作用,以确定由以上四药组成新型多靶点复方抗肿瘤药物的最佳配伍,并对其进行进一步的体内、外抗肿瘤作用和机制的分析。一、氟尿嘧啶、顺铂、长春瑞滨和吉西他滨抗肿瘤最佳剂量及配伍筛选目的:寻找5-FU、DDP、GEM、VRB最佳组合方案。方法:（1）MTT法测定5-FU、DDP、GEM和VRB各药抑制H₂₂细胞生长的剂量-效应曲线,从中选出抑制率低于30%的剂量点。（2）以确定的剂量的5-FU、DDP、GEM和VRB不同配伍组合,MTT法检测各组合对H₂₂细胞生长的抑制作用,选出最佳组合。结果:1各药单用对肝癌H₂₂细胞的生长抑制作用5-FU、DDP、GEM和VRB抑制H₂₂细胞生长的IC50分别为490.79,10.01,0.021,16.49μmol/L。而各药低于抑制H₂₂细胞生长IC30的剂量:5-FU为0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8μmol/L,DDP为0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μmol/L,GEM为0.000128、0.00064、0.0032μmol/L,VRB为5×10-7、5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3μmol/L。2联合用药对肝癌H₂₂细胞生长的抑制作用在各药物的两两组合、三三及四四组合中,以5-FU（0.8μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）和5-FU（0.8μmol/L）+DDP（5μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）组合对H₂₂细胞生长的抑制最为明显。5-FU（0.8μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）对H₂₂细胞生长的抑制率为40.84%±6.17%,显著高于5-FU（21.34%±4.26%）或VRB（21.1%±11.44%）单独应用（P<0.01）。5-FU（0.8μmol/L）+DDP（5μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）三者组合对H₂₂细胞生长的抑制率为41.06%±3.78%,与5-FU+VRB组合比较无明显差异。因而药物最佳作用的组合为5-FU（0.8μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）。结论:5-FU（0.8μmol/L）和VRB（0.005μmol/L）低剂量联合应用对H₂₂细胞的生长抑制具有显著协同作用,有望成为以上四种作用机制不同的抗肿瘤药物中的最佳配伍。二、氟尿嘧啶和长春瑞滨协同抗肿瘤作用及机制研究目的:探讨5-FU（0.8μmol/L）+VRB（0.005μmol/L）对小鼠肝癌H₂₂细胞体外生长、小鼠体内荷瘤生长的抑制作用及其作用机制。方法:（1）MTT法测定5-FU+VRB对细胞活性的影响;（2）测定5-FU+VRB对细胞培养上清液中坏死细胞和凋亡细胞LDH泄漏率（LDH）的影响;（3）丫啶橙/溴化乙锭染色,在激光共聚焦显微镜下观察5-FU+VRB对细胞凋亡的影响;（4）流式细胞仪分析5-FU+VRB对细胞凋亡和增殖的影响。（5）观察5-FU+VRB对小鼠移植H₂₂肝癌肿瘤瘤重,抑制率的影响,观察5-FU+VRB对胸腺指数、脾脏指数和白细胞数等的影响。结果:（1）5-FU+VRB作用48¹20h内两药合用效果均高于两药单独应用时（P<0.01,P<0.01）,且72h时作用达最高峰（47.70±5.40%）。（2）LDH泄漏率（LDH%）:5-FU+VRB组各时间点细胞坏死率（LDHn%）与其他组相比,均无统计学意义;细胞凋亡率（LDHa%）随时间延长而增大,96h、120h、144h、168时,5-FU+VRB显著高于其他组（P<0.01）。（3）细胞形态:非凋亡细胞的胞核为绿色荧光深浅不一的结构样特征。凋亡细胞的胞核呈现为黄色强荧光染色,细胞核染色质固缩,体积缩小,早期凋亡细胞还可见典型的胞膜出泡现象,5-FU+VRB组细胞数量明显低于其它组。（4）细胞周期、凋亡:H₂₂细胞呈现出明显的亚二倍体凋亡峰,5-FU+VRB组凋亡率（40.65±7.44%）高于空白组（16.71±1.49%）、5-FU组（22.46±1.90%）、VRB组（21.64±1.98%）（P<0.01,P<0.05, P<0.05）。5-FU+VRB组细胞增殖较其它组显著下降（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。（5）对荷瘤小鼠的影响:5-FU+VRB高、中两个剂量对荷瘤小鼠的肿瘤生长有显著抑制作用,其抑瘤率分别为60.61%和21.21%（P<0.01,P<0.05）。高剂量5-FU+VRB也明显降低小鼠白细胞数（P<0.01）和胸腺、脾脏重量,而中、低剂量则无明显影响。结论:5-FU和VRB合用在体内、外均呈现显著的协同抗肿瘤作用,此作用可能与其抑制肿瘤细胞代谢活性、诱导肿瘤细胞凋亡、坏死以及破坏肿瘤细胞细胞膜的完整性有关。但在高剂量时其副作用亦有增强。