论文部分内容阅读
目的:程序性死亡受体-配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)的表达是导致胃癌免疫逃逸的主要原因之一,然而,调控胃癌细胞PD-L1表达的具体机制尚不清楚。间质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有广泛的免疫抑制潜能以及促进血管生成、肿瘤生长、上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤转移的能力,是肿瘤微环境中(Tumor microenvironment,TME)备受关注的细胞组分。本研究旨在探讨胃癌间质干细胞(Gastric cancer MSCs,GCMSCs)通过调节胃癌细胞PD-L1的表达促进肿瘤进展,并探讨其具体分子机制。方法:采用贴壁法分离获得GCMSCs,并通过细胞表面标志物(CD105、CD90和CD29)以及体外分化实验对GCMSCs进行鉴定。利用免疫组织化学染色法检测胃癌组织和癌旁组织中PD-L1的表达,Western blot检测不同胃癌细胞株PD-L1表达水平。收集骨髓间质干细胞上清(Conditioned medium of bone marrow MSCs,BMMSC-CM)及GCMSCs上清(Conditioned medium of GCMSCs,GCMSC-CM)并处理胃癌细胞24 h,用流式细胞术和Western blot检测其PD-L1表达水平,ELISA检测其分泌的游离PD-L1(soluble PD-L1,sPD-L1)含量。利用细胞毒性实验检测GCMSC-CM对胃癌细胞抵抗细胞毒性作用的影响。通过免疫荧光的方法比较GCMSCs与GCMSC-CM上调胃癌细胞PD-L1表达的差异,并用细胞因子芯片筛选GCMSC-CM中调控胃癌细胞PD-L1表达的关键分子,采用细胞因子中和抗体、信号通路抑制剂以及细胞因子标准品来进一步明确GCMSC-CM促进胃癌细胞PD-L1表达的机制。联合使用IL-8和PD-L1中和抗体来观察GCMSCs对胃癌细胞抵抗细胞毒性作用的影响。根据干性标志物(CD44、Sall4、Nanog、Oct4和Sox2)的表达、ALDH活性、迁移和成球的能力来评价胃癌细胞干细胞样特性。通过PD-L1慢病毒过表达或siRNA-PD-L1干扰胃癌细胞中PD-L1的表达,观察PD-L1对胃癌细胞干性的影响。采用质谱方法分析胞内与PD-L1相结合并调控胃癌细胞干性的分子,通过免疫共沉淀实验进一步验证。通过流式细胞术分选PD-L1表达阴性或阳性的细胞并进行限制性稀释实验以明确PD-L1对胃癌细胞体内致瘤能力的影响。结果:从胃癌组织中成功分离获得GCMSCs,体外分化实验结果显示GCMSCs可分化成脂肪细胞和骨细胞,免疫表型分析显示GCMSCs表达CD105、CD90和CD29阳性,而CD45、CD34和CD19表达阴性。胃癌患者肿瘤组织中PD-L1的表达量明显高于相应的癌旁组织,且不同胃癌细胞株中PD-L1水平存在差异,其中SGC-7901表达水平较高,MGC-803表达水平较低。与BMMSC-CM相比,GCMSC-CM上调胃癌细胞PD-L1表达能力更强,且GCMSC-CM能够促进胃癌细胞分泌sPD-L1。经GCMSC-CM处理不同时间后胃癌细胞PD-L1表达水平均上调,在24 h PD-L1的表达处于较高水平。GCMSCs和GCMSC-CM上调胃癌细胞PD-L1的作用是相似的,通过细胞因子芯片和细胞因子中和抗体进一步证实,GCMSC-CM主要通过分泌IL-8促进胃癌细胞中PD-L1的表达。GCMSC-CM促进胃癌细胞中c-Myc和PD-L1的表达,且抑制c-Myc后PD-L1水平下降。抑制c-Myc也逆转了GCMSC-CM对胃癌细胞抵抗CD8~+T细胞的细胞毒性的促进作用。GCMSCs来源的IL-8通过激活STAT3和mTOR信号通路调控c-Myc诱导胃癌细胞PD-L1表达。结果表明,PD-L1中和抗体使SGC-7901对CD8~+T细胞的敏感性增强,而对GCMSC-CM促进胃癌细胞抵抗细胞毒性的作用影响很小,当联合阻断PD-L1与IL-8后,这种抵抗作用明显减弱。进一步的研究证明,GCMSC-CM增强了胃癌细胞干性标志物(CD44、Sall4、Nanog、Oct4和Sox2)的表达以及ALDH的活性、迁移和成球能力。然而,当胃癌细胞中的PD-L1被阻断时,这些效应大大减弱。胃癌细胞中PD-L1的下调显著降低干性标志物的表达水平,且使GCMSC-CM对胃癌细胞干性的作用也明显减弱。同时,在PD-L1过表达的胃癌细胞中,干性标志物的表达、迁移能力和成球能力均显著增强。质谱分析结果显示,胃癌细胞中的PD-L1与转录因子CCCTC-结合因子(CTCF)相结合,其与干性相关并参与肿瘤细胞的自我更新。免疫共沉淀实验进一步验证胃癌细胞中PD-L1与CTCF存在相互作用。干扰CTCF的表达显著降低干性标志物表达水平以及胃癌细胞的ALDH活性、迁移能力和成球能力。胃癌细胞经GCMSC-CM处理后,分选PD-L1表达阴性或阳性的细胞进行限制性稀释实验,结果证明PD-L1表达阳性的胃癌细胞具有更强的干性以及致瘤能力。结论:GCMSC-CM通过IL-8-STAT3/mTOR-c-Myc信号轴上调胃癌细胞PD-L1表达并促进胃癌细胞抵抗CD8~+T细胞的细胞毒性作用;联合阻断IL-8和PD-L1有效抑制了GCMSCs促胃癌细胞抵抗细胞毒性CD8~+T细胞杀伤的作用;GCMSCs调控PD-L1-CTCF增强胃癌细胞干细胞样特性;PD-L1表达阳性的胃癌细胞相较于PD-L1表达阴性的胃癌细胞具有更强的促进胃癌发生发展的能力。本研究为胃癌的诊疗及提高免疫治疗疗效提供了新的靶点,也为缓解胃癌患者的治疗抵抗提供潜在策略。