研究背景与目的:创伤（trauma）是全球都需要面对的公共卫生问题。据世界卫生组织（world health organization,WHO）统计,国外发达国家每年约新增加300～900万创伤患者。而在我国,创伤患者人数已高达6200万,其中致死人群达70～80万。如今,创伤已经成为45岁以下人群的首要致死原因。如果创伤后发生感染,可导致脓毒症（spesis）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）等并发症,增加创伤患者的高致残率甚至死亡几率。在过去的几十年中,耐药细菌株的出现导致创伤细菌感染的问题更加复杂。对多种抗生素具有耐药性的大肠杆菌菌株是创伤后感染重要问题。氧化应激（Oxidative Stress,OS）的概念于1985年引入氧化还原生物学和医学领域。氧化应激是细胞和组织中活性氧（ROS）的产生和积累与生物系统对其清除能力之间的不平衡造成的一种现象。可产生氧化应激的途径有很多,包括过氧化氢、亚砷酸盐、谷氨酸盐、6-羟基多巴胺等。严重的氧化应激对于人体的毒性作用,包括促进衰老、糖尿病、心血管和神经系统病变等。但经低剂量氧化应激诱导可对机体产生保护作用。例如,低剂量H2O2诱导处理可保护PC12细胞免受高剂量H2O2造成的细胞凋亡[1]。巨噬细胞属于先天免疫系统的细胞成分,几乎存在于所有组织中。在维持组织免疫监视中起着至关重要的作用,在致病性感染和组织损伤过程中也有助于炎症反应和修复反应。就炎症反应而言,小鼠腹膜巨噬细胞是研究最多的巨噬细胞群体之一。在感染控制、病理性炎症以及维持免疫功能方面,腹腔巨噬细胞都表现出不可或缺的稳定作用。鉴于低剂量H2O2诱导后对机体产生保护作用,以及为探索与腹腔巨噬细胞之间是否存在关联性。我们构建了创伤致死性感染小鼠保护模型,并且选取小鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象。首先,研究前期的低剂量过氧化氢诱导是否对小鼠的生存以及脏器起到保护作用。其次,研究低剂量过氧化氢诱导对腹腔巨噬功能的影响,包括对其吞噬作用和趋化作用的影响。最终,建造一个创伤感染保护模型,并研究其中的内在联系,且这种模型可以抵御多种细菌侵袭。实验方法:一、低剂量过氧化氢诱导对创伤感染后小鼠生存和脏器保护的影响1.对小鼠进行造模分组,空白感染组（无任何处理+感染）、创伤感染组（创伤失血后非诱导+感染）、创伤后低剂量过氧化氢诱导感染组（创伤失血后低剂量过氧化氢诱导+感染）（后面简称诱导感染组）。首先,将创伤感染组及诱导感染组的小鼠进行创伤失血造模。其次,用低剂量过氧化氢对诱导组小鼠进行为期3天（间隔24 h一次）的腹腔注射诱导（60 mg/kg,100 μl/只）,用灭菌水对空白感染组和创伤感染组小鼠同时进行为期3天（间隔24h一次）的腹腔注射诱导（100μl/只）。三组小鼠诱导结束后对所有小鼠腹腔注射相同剂量的大肠杆菌（3 × 108 CFU/ml）。同时,空白感染组和创伤感染组每只小鼠腹腔注射同等剂量过氧化氢（60 mg/kg,100 μl/只）。最后,然后绘制72 h小鼠生存曲线。（具体见图1）图1创伤感染小鼠模型建造流程2.小鼠模型同上,我们将在空白感染组和创伤感染组在大肠杆菌注射后4 h后提取脏器（心、肝、肺、肾）以及眼球取血,而诱导感染组分别于注射大肠杆菌后4h和48 h进行提取脏器（心、肝、肺、肾）以及眼球取血。最终分别保存。3.将每次提取的血液进行离心保留血清。进行谷草转氨酶、肌酐、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶检测。4.取2个批次的心脏、肝脏、肺脏、肾脏进行病理切片HE染色。二、低剂量过氧化氢诱导对小鼠腹腔巨噬趋化作用的影响首先,我们对小鼠进行前期分组:包括前期空白组和前期统一创伤组。诱导结束后,我们只对各组一半小鼠行腹腔大肠杆菌注射。最终分组:空白非感染vs创伤非感染组vs诱导非感染组,空白感染组vs创伤感染组vs诱导感染组。给菌4小时后提取小鼠原代腹腔巨噬细胞。利用细胞计数仪对每组每只进行巨噬细胞计数。三、低剂量过氧化氢诱导对小鼠腹腔巨噬吞噬作用的影响1.我们对小鼠进行造模分组,包括空白感染组组、创伤感染组、诱导感染组。诱导结束后三组小鼠都不进行腹腔注射大肠杆菌,并采用注射的同一时间点对每组小鼠进行处死,提取小鼠腹腔巨噬细胞。然后,离心去上清,细胞铺版,构建体外大肠杆菌感染模型。感染一小时后对每组细胞取相同计数,进行LB固体琼脂板细胞铺板。细菌培养箱37℃培养12 h后进行单个菌落计数。2.建立低剂量过氧化氢诱导保护体外模型。首先,取正常小鼠的腹腔巨噬细胞,细胞数均铺在6孔板中（空白12 h组和诱导12 h组,空白24 h组和诱导24 h组,空白36 h组和诱导36 h组）。12小时进行一次过氧化氢诱导10 μM/次。到时间后利用Trizol对每孔细胞进行收集。利用qRT-PCR的方法检测细胞中吞噬作用相关蛋白（Aif1、Marco和Fgr）表达水平。实验结果:一、低剂量过氧化氢诱导对创伤感染后小鼠生存和脏器保护的影响1.创伤感染后小鼠致死模型的结果显示,经过低剂量H2O2诱导的创伤感染小鼠生存率明显提高,生存时间延长。2.经过生化检验结果显示,经过低剂量H2O2诱导的小鼠AST、Crea、CK、CK-MB等指标降低。3.病理切片HE染色结果显示,低剂量H2O2诱导后对创伤感染后小鼠脏器病理状态学损伤得到改善。二、低剂量过氧化氢诱导对小鼠腹腔巨噬趋化作用的影响经过低剂量H2O2诱导的创伤感染小鼠腹腔巨噬细胞比起创伤感染组巨噬细胞数量增加。三、低剂量过氧化氢诱导对小鼠腹腔巨噬吞噬作用的影响1.经过低剂量H2O2诱导的创伤感染小鼠腹腔巨噬细胞比起创伤感染组,其吞噬细菌数量明显增加。2.经过低剂量H2O2诱导的小鼠腹腔巨噬细胞比起创伤感染小鼠Aif1、Marco和Fgr的表达增加。结论:1.经过低剂量H2O2诱导可以增加创伤感染小鼠的生存率。2.低剂量H2O2诱导后对创伤感染后小鼠脏器具有一定的保护作用。3.经过低剂量H2O2诱导的创伤感染小鼠腹腔巨噬细胞比创伤感染组促进了 Aif1、Marco、Fgr的表达,具有更强的吞噬及趋化能力。