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目的:观察肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)对幼年大鼠心肌细胞(cardiacmyocyte)凋亡的影响,并探讨其可能的作用受体及其信号转导途径。
方法:1.细胞分离培养与鉴定:用酶消化法分离细胞,差速贴壁法和药物抑制成纤维样细胞纯化获得心室肌细胞为材料,用光学显微镜和免疫细胞化学的方法鉴定细胞。2.检测方法:MTT比色法测定细胞活度,双苯并咪唑(Hoechst33342)染料荧光显微镜检测和DNA末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡率,免疫细胞化学方法检测细胞内蛋白激酶B(Akt)的表达。3.实验分组:根据不同的药物及药物不同浓度,实验共分五部分,第一部分:观察ADM对基础状态下的心肌细胞是否有影响。共分5组:不同浓度(10-10~10-7M)的ADM组和空白对照组。第二部分:观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是否能够诱导心肌细胞凋亡,并确定合适的诱导细胞凋亡模型的实验浓度。共分5组:不同浓度的(10-9~10-6M)AngⅡ组和空白对照组。第三部分:观察ADM对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响。共分6组:空白对照组,AngⅡ(10-7M)诱导凋亡对照组,不同浓度的ADM(10-10~10-7M)+AngⅡ(10-7M)组。第四部分:ADM在心肌细胞上作用的受体观察ADM对心肌细胞凋亡的影响:分别以CGRP受体拮抗剂(CGRP8-37)和ADM特异性受体拮抗剂(ADM22-52)进行干预研究,共分6组:空白对照组,AngⅡ对照组,AngⅡ+ADM对照组,AngⅡ+ADM+CGRP8-37组,AngⅡ+ADM+ADM22-52组,AngⅡ+ADM+CGRP8-37+ADM22-52组。第五部分:ADM在心肌细胞受体后信号转导途径的研究:①采用cAMP抑制剂(Br-cAMP)进行干预研究,共分4组:空白对照组,AngⅡ对照组,AngⅡ+ADM对照组,Br-cAMP+AngⅡ+ADM组;②对于Akt/PKB途径研究分3组:设置空白对照组,AngⅡ对照组,AngⅡ+ADM对照组,用特异性Akt单克隆抗体对此3组进行免疫细胞化学法检测。4.数据处理:用SPSS12.0软件包;细胞活度A值数据用均数±标准差(-x±s)表示,单因素方差分析进行统计学处理,两两比较采用LSD法,P<0.05为有统计学意义;细胞凋亡率数据处理,采用卡方检验,两两比较采用标准四格表法,检验水准为P<0.05有统计学意义。
结果:1.培养的细胞经过光学显微镜和免疫细胞化学的方法鉴定为心肌细胞,纯度达95%以上。
2.ADM在基础状态下对心肌细胞凋亡无明显影响,ADM各浓度组(10-10~10-7M)与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3.ADM呈浓度依赖性地抑制AngⅡ的诱导心肌细胞凋亡作用。ADM+AngⅡ各浓度组(10-10~10-7)A值明显高于AngⅡ组(P<0.05),细胞凋亡率随浓度的增加而降低,各浓度组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。10-7M浓度的ADM抑制AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的作用最为显著,与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)。
4.ADM在心肌细胞上作用受体的研究:在AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的情况下,CGRP8-37和ADM22-52能显著拮抗ADM对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的抑制作用,与AngⅡ+ADM对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),二拮抗剂单独作用均不能完全拮抗ADM作用,与AngⅡ组比较差异显著(P<0.05),二者合用也不可完全拮抗ADM作用,与AngⅡ组比较差异显著(P<0.05)。
5.ADM在心肌细胞受体后信号转导途径的研究显示:cAMP抑制剂Br-cAMP能阻断ADM对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的抑制作用,与AngⅡ+ADM对照组比较有显著差异(P<0.01),与AngⅡ组比较仍有显著差异(P<0.01)。Akt免疫细胞化学,AngⅡ+ADM组可见少量细胞阳性,说明受体后的Akt/PKB途径在一定意义上可能参与了ADM对心肌细胞凋亡的保护作用。
结论:1.ADM对基础状态下的心肌细胞无影响;
2.ADM呈浓度依赖性地抑制AngⅡ介导的心肌细胞的凋亡。
3.心肌细胞上存在着CGRP受体和ADM特异性受体两种受体,ADM可能是通过这两种受体途径参与心肌细胞凋亡保护作用,还可能存在其他受体;
4.ADM抑制心肌细胞凋亡主要机制可能是通过依赖cAMP的途径介导;
5.受体后Akt/PKA途径可能是ADM抑制细胞凋亡的通路之一。