水稻胚乳是人类重要的粮食来源,也为胚胎的生长发育提供营养。水稻胚乳发育伴包括细胞有丝分裂、核内复制和营养物质的积累,以及淀粉胚乳细胞的PCD等过程。虽然已经鉴定了一些胚乳发育相关的基因及其功能,但是鉴于水稻胚乳发育的特殊性,其细胞分裂与分化的分子调控机制的研究仍十分缺乏,胚乳储藏物质特别是脂类物质积累的分子机制尚有许多空白。本研究选取10个编码转录因子或表达蛋白的水稻种子(胚乳)高表达的基因,借助于T-DNA插入突变体以及RNAi和超表达等方法获得转基因材料,以研究这些基因在水稻种子(胚乳)发育中的功能和作用机制。本文重点对一个假定的脂转运蛋白OsLTPL36和F-box蛋白OsEnF进行了研究,获得如下结果:1.对OsLTPL36进行序列分析及分子建模,发现其蛋白序列中存在由22个氨基酸残基组成的信号肽;具有8个半胱氨酸残基(Cys)能形成4对二硫键和稳定的疏水环境。另外,OsLTPL36蛋白具有类似于“手型”的三级结构。表明OsLTPL36具有脂质转运蛋白类的基本模体,可能是一个脂质结合蛋白。2.表达分析显示OsLTPL36只在水稻发育的种子中特异表达,在开花后7天的种子种中表达量最高,尤其是在种皮和糊粉层细胞中高表达,证实OsLTPL36是水稻种子特异表达的基因。3.OsLTPL36-RNAi转基因T2代家系在营养生长阶段无明显异常,但种子的结实率和千粒重较野生型显著降低,成熟种子中存在较严重的垩白现象。种子成分测定结果显示,转基因家系种子中蛋白质和脂质的含量显著少于野生型,采用气相色谱分析发现C16:0(棕榈酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:1(油酸)、C18:2(亚油酸)和C18:3(亚麻酸)含量显著降低。扫描电镜观察发现转基因家系胚乳的淀粉颗粒形态异常、大小变小及排列疏松。这些结果表明,OsLTPL36在水稻种子的脂质和蛋白质积累中具有重要功能,可能也影响胚乳淀粉颗粒的形态。4.细胞学观察结果表明,OsLTPL36-RNAi植株胚的发育延迟、胚胎畸形。种子萌发实验结果显示RNAi家系中种子的萌发率显著低于野生型,幼苗的生长势也较野生型弱。我们推测OsLTP36可能通过调节种子中储藏的脂质等物质,参与胚胎发育和种子萌发的调节。5.OsEnF编码一个F-box蛋白,qRT-PCR检测结果显示OsEnF在发育的种子中特异表达,在开花后5-21天的胚乳中表达量最高;mRNA原位杂交和pOsEnF:gfp转基因植株验证了这一表达模式,表明OsEnF是一个水稻种子特异表达的基因。6.对OsEnF的T-DNA插入突变体的基因型鉴定和表型分析显示,osenf纯合突变植株的结实率和千粒重较野生型显著降低,籽粒充实度也降低,常形成一定比例的皱缩种子。细胞学观察结果进一步揭示突变体种子发育缺陷,在授粉后5～7天的种子中,胚乳细胞数量较野生型显著减少,在发育后期的种子中,因胚乳细胞数量少而形成空腔,导致空瘪籽粒。种子中的胚胎也出现畸形或巨大胚的异常现象。osenf突变体种子中蛋白质和淀粉的含量也显著低于野生型。OsEnF-RNAi转基因家系呈现出与osenf纯合突变体类似的种子发育缺陷。OsEnF表达下调导致细胞周期相关和储藏物质相关基因的表达下调。这些结果表明OsEnF可能是水稻种子发育的重要调节因子,参与胚乳细胞分裂和储藏物质积累的调控。7.酵母双杂结果显示OsEnF与水稻中的Skp1同源蛋白发生互作,表明其可能参与形成Skp-Cull-F-box(也称SCF)复合物。利用水稻种子的酵母双杂交文库,筛选到与OsEnF发生互作的水稻多梳蛋白(Polycomb protein)OsFIE2。Pull-down实验进一步验证了 OsEnF与OsFIE2的互作。非细胞体外降解实验表明,OsFIE2蛋白的降解依赖于蛋白酶体系统。基于已有的结果,我们推测OsEnF可能参与SCFE3泛素连接酶复合体,通过降解其靶蛋白OsFIE2参与种子发育的调控。