金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类富含半胱氨酸、低分子量(2～7kDa)、无芳香族氨基酸和组氨酸、能与金属结合的非常独特的蛋白质,它在生物界中广泛分布。近年来的研究表明,MT参与体内微量元素的储存、转运和代谢,拈抗电离辐射、清除自由基以及对重金属的解毒作用。甲壳类动物的MT发现相对较晚。研究表明,MT可以通过其大量的Cys残基螯合重金属并清除活性氧,使动物体免受氧化损伤,参与动物的发育、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能蛋白。本课题组在前期承担的国家自然科学基金(No.30640051)中,系统地研究了华溪蟹主要组织MT表达情况以及与重金属蓄积的关系,并完成了镉诱导河南华溪蟹(Sinopotamon henanense) MT cDNA全长序列的克隆。在此基础上,本研究采用PCR扩增技术,将克隆得到的MT基因两端加上酶切位点,然后使用基因重组技术将获得的MT基因分别克隆至pET28a、 pET28a-SUMO和pGEX-6p-1三个表达载体上,构成重组表达载体,测序公司的测序结果证明三种重组表达载体均构建成功。将三种重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,诱导表达目的蛋白,收集菌体超声波破壁后的上清液,经SDS-PAGE分析表明,IPTG成功诱导了MT蛋白的表达,并且根据SDS-PAGE电泳结果比较分析三种重组质粒中MT的表达量,最终确定MT在SUMO融合表达系统中可溶性表达量更高。通过研究诱导温度、诱导时间和诱导浓度三个条件对MT融合蛋白表达量的影响,优化了SUMO原核表达系统的诱导表达条件,最终确定在37℃条件下使用1mmolIPTG诱导6小时,MT融合蛋白的可溶性表达量最高。用SUMO表达系统获得的MT融合蛋白携带有his标签,使用Ni亲和层析法纯化MT融合蛋白,经咪哗缓冲液洗脱后,收集纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳分析表明蛋白纯化效果较好,去除大部分的杂蛋白,获得了较纯的MT融合蛋白。本论文采用定点突变技术,对MT的一级结构经行了部分改造,构建了两种突变体SUMO-MTt1和SUMO-MTt2,诱导表达SUMO-MTt1SUMO-MTt2, SUMO-MT和GST-MT四种融合蛋白,在诱导的过程中分别加入终浓度为300μMn的Cu、Cd、Zn三种重金属离子,诱导完成后用火焰原子及收光谱法,测定了表达菌体中重组MT对Cu、Cd、 Zn种金属的吸附能力。结果表明,与空菌体比较,4种MT融合蛋白对Cu、Cd、Zn三种金属离子具有很明显的结合能力,但是每一种MT融合蛋白对不同的金属离子的结合能力是有差异的。总体来看,四种MT融合蛋白对Cd的吸收量最大,而对Zn和Cu的吸收能力相近。比较四种蛋白对同种金属离子的吸收量可以看出,经过一级结构改造的突变体比未突变的蛋白结合能力更强,尤其是在对Cd2+的吸收能力上，SUMO-MTt1比未改造的SUMO-MT有明显的提高,这可能与Cys的数量、位置以及中间连接区的长短有关。