一.研究目的：研究Smad相互作用蛋白-1(Sipl/Zfhx1b)对少突胶质细胞分化成熟的调节作用,以及发现Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促进少突胶质细胞分化成熟和启动髓鞘生成作用的分子机制。二.研究方法：1.Sip1/Zfhx1b在少突胶质细胞分化成熟中的作用：(1)免疫染色法测定Sip1在中枢神经系统内少突胶质细胞丰富区域的表达情况；(2)原位杂交技术确定Sip1在脊髓中的发育情况；(3)建立少突胶质细胞内Sip1特异性敲除模型,评价Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影响；(4)Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位杂交技术评价与少突胶质细胞分化成熟的相关标记物的变化情况；(5)电镜下观察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的变化情况；(6)免疫染色法评价体外敲除Sip1基因对少突胶质细胞的影响；(7)Sip1敲除小鼠模型中,原位杂交技术确定OPC的增殖能力的改变情况。2. Sipl/Zfhx1b调控少突胶质细胞分化成熟和启动髓鞘生成作用的分子机制研究：2.1 Sipl/Zfhx1b调控少突胶质细胞分化成熟相关通路的分子机制研究(1)荧光素酶报告基因法确定Sip1对少突胶质细胞分化成熟相关的调控因子和髓鞘基因的改变情况；(2)免疫共沉淀法和Western-blotting法检测Smad通路蛋白的表达情况；(3)免疫荧光法测定磷酸化Smad1的在体内的变化；(4)免疫荧光技术检测在OPC内过表达Sip1后OPC的分化成熟情况；(5)实时荧光定量PCR法检测细胞内过表达Sip1后与少突胶质细胞分化成熟相关通路的改变情况；(6)原位杂交技术,免疫染色法和实时定量PCR检测动物体内髓鞘相关基因或蛋白的表达情况；(7)染色质免疫共沉淀检测Sip1与少突胶质细胞发育相关的基因启动子的结合能力。2.2 Sip1/Zfhx1b调控少突胶质细胞分化成熟时直接下游基因的鉴别(1) Gene-chip microarray法鉴别Sip1直接作用的下游基因；(2)原位杂交技术观察Smad7在老鼠脊髓发育过程的表达情况；(3)免疫染色法观察Smad7在脊髓少突胶质细胞内的表达情况；(4)鸡胚神经管内过表达Smad7对少突胶质细胞标记物的影响；(5)免疫荧光法和实时荧光定量PCR法检测Smad7和Sip1在OPC和OLs两个阶段的表达情况；(6)染色质免疫共沉淀法测定Sip1结合Smad7启动子的能力；(7)实时荧光定量PCR测定Sip1过表达后对Smad7的影响；(8)免疫荧光法测定Smad7过表达后对Sip1缺失的少突胶质细胞分化的影响；(9) Western blot法测定Smad7过表达后对BMP信号通路和其他通路的影响；(10)Smad7敲除小鼠模型中,原位杂交技术评价与少突胶质细胞分化成熟的相关标记物的变化情况。三.研究结果：1. Sipl/Zfhxlb敲除引起少突胶质细胞分化成熟和中枢神经系统髓鞘生成的缺陷(1)Sip1表达在中枢神经系统内脑的皮层和白质区域以及脊髓的白质区较多,并且在成熟的CC1+的OLs内表达较强,而在PDGFRα+的OPC内表达相对较弱；(2)胚胎期E14.5～16.5时,Sip1在脊髓的白质区域没有表达,而在生后当天(P0)在脊髓的腹侧出现,随着时间增加表达不断增多；(3)少突胶质细胞内Sip1特异性敲除小鼠(Sip1cKO)出现震颤,发抖,共济失调性步态行走等表型,并且在两周左右出现死亡；(4) Sip1cKO小鼠中,成熟髓鞘蛋白髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP1)在脊髄和大脑白质区域明显下降或完全消失,CC1蛋白表达明显下降；(5) P14 Sip1cKO小鼠视神经和脊髓内几乎没有髓鞘的生成；(6) Cre-GFP病毒感染的Sipc/c细胞分化能力明显减弱,细胞的分化被阻断在OPC阶段；(7)P14的Sip1cKO小鼠和野生型小鼠PDGFRα+的细胞没有明显差异,OPC增殖能力也未受到影响。2. Sip1/Zfhx1b通过BMP/Smad通路调控少突胶质细胞分化成熟和启动髓鞘生成2.1 Sip1/Zfhx1b通过和p-Smad1相互作用调控少突胶质细胞分化成熟：(1)Sipl和受体激活的Smad1相互作用逆转BMP通路对MBP启动子的抑制作用,也可改变BMP通路对Id2,Id4和Hes1的活化作用；(2)Co-IP结果表明Sip1只能同磷酸化的Smad1相互结合；在少突胶质细胞原代培养中,Sip1在OLs蛋白表达增加,并且通过p300介导同p-Smad1相互作用；(3)pSmad1的表达在P14Sip1cKO和野生型小鼠脊髓腹侧部中没有明显变化；(4)OPC内过表达Sipl后,Rip+成熟前少突胶质细胞细胞量明显增加,PDGFRa+的OPC细胞量显著减少；(5)在HCN细胞内电转过表达Sip1,24h后Sip1mRNA水平升高,同少突胶质细胞形成正相关的一些因子mRNA水平也明显增加；而在Oli-neu细胞中过表达Sip1可显著降低抑制少突胶质细胞分化因子的mRNA水平；(6)P14的Sip1cKO小鼠的脊髓内MRF,Sox10和Cgt表达水平明显下降；(7)Sip1能同MRF和Sox10的启动子区域结合,而且Sip1能同Id2,Id4和Hesl的启动子区域结合。结合同通过调节染色质的甲基化而促进少突胶质细胞的分化。2.2 Sip1/Zfhx1b通过诱导Smad7的增加调控少突胶质细胞分化成熟：(1)Gene-chip microarray法鉴别出多种基因都受到Sipl调控,在其中我们发现了Smad7可能直接被Sipl调控；(2)小鼠脊髓发育过程中,PO的小鼠脊髓内可检测到Smad7信号,并且主要集中在白质区腹侧部,随着时间的增加在P14达到峰值,随后其表达又下降；(3)脊髓内,Smad7在OPC和成熟少突胶质细胞的两个阶段都有表达；(4)鸡胚神经管内过表达Smad7能促进PDGFRα+和Sox10+的异位表达；(5)Smad7和Sip1在OPC和OLs两个阶段都有表达,但是两者的蛋白水平和mRNA水平都在OLs内表达增加；(6)OLs内Sipl和Smad7启动子的不同区域结合能力很强,而OPC内Sipl完全没有结合到Smad7的启动子区域；(7)HCN内过表达Sipl,Smad7mRNA水平明显增加；(8)Smad7过表达可明显改善Sip1缺失的少突胶质细胞分化缺陷；(9)Smad7和Smurf1两者共表达组,BMPR1a, p-Smad1和β-catenin蛋白水平明显降低；(10)Smad7敲除小鼠模型中,Mbp和Plpl mRNA明显降低,但PDGFRa+mRNA水平没有明显改变。四.结论：(1)体内外敲除Sip1都能显著抑制少突胶质细胞的分化成熟。(2)体内敲除Sip1可引起小鼠的髓鞘生成障碍。(3)Sip1与Smad1相互作用可调控少突胶质细胞分化成熟。(4)Sip1通过诱导Smad7的增加,进而抑制Smad1的磷酸化来调控少突胶质细胞分化成熟因此,Sip1在少突胶质细胞成熟过程中是必不可少的,主要通过抑制受体激活的Smad信号通路,影响少突胶质细胞分化相关的关键因子；并且Sip1在少突胶质细胞中的下游基因Smad7可直接抑制BMP信号通路的激活。Sip1通过正、负两方面的调控手段抑制了BMP信号通路,进而促进了中枢神经系统内的髓鞘生成。