【摘 要】
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口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种烈性传染病,主要感染猪、牛、羊等70多种偶蹄动物。该病具有传播途径多、传播速度快、传播范围广的特点,往往在发病地区大规模流行,导致畜牧产品质量严重下降,严重影响当地畜牧行业的发展。世界动物卫生组织（World organization for
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口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种烈性传染病,主要感染猪、牛、羊等70多种偶蹄动物。该病具有传播途径多、传播速度快、传播范围广的特点,往往在发病地区大规模流行,导致畜牧产品质量严重下降,严重影响当地畜牧行业的发展。世界动物卫生组织（World organization for animal health,OIE）将其列为A类动物传染病之首。基于口蹄疫传播与发病的特性,口蹄疫的预防成为控制口蹄疫的主要手段。目前,许多国家均使用灭活疫苗来预防口蹄疫,虽然灭活疫苗在口蹄疫防治中成绩斐然,但也存在诸多缺点,如容易在生产过程出现活病毒外逸的风险,疫苗灭活不彻底,因此对安全高效的新型口蹄疫疫苗的研发是十分迫切的。FMDV为单股正链RNA病毒,由VP1、VP2、VP3、VP4四种蛋白组成的衣壳包裹RNA形成正二十面体形状的病毒粒子,无囊膜。VP4位于衣壳内部与RNA核心结合,VP1、VP2、VP3暴露在衣壳外部,其中VP1含有FMDV主要抗原位点,是激发动物体发生细胞免疫和体液免疫的关键抗原蛋白。本研究主要运用基因工程技术,通过大肠杆菌表达系统和杆状病毒表达系统对O型FMDV的VP1蛋白进行表达与纯化,为口蹄疫亚单位疫苗的研发与口蹄疫相关试剂盒的开发提供技术参考。经过试验,获得以下结果:（1）在VP1的原核表达中,构建了p ET28a（+）-T7-VP1重组质粒,使用Rosetta（DE3）菌株进行诱导表达重组VP1-6×His蛋白,并对表达条件进行了优化;SDSPAGE检测结果显示IPTG浓度和温度的变化对重组VP1-6×His蛋白的表达形式影响不大,均是以大量的包涵体形式存在;对包涵体进行了变性与复性,用NGC中高压纯化系统对复性后的重组VP1-6×His蛋白进行镍柱亲和层析纯化,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定,结果显示成功获得纯度较高的重组VP1-6×His蛋白。（2）在VP1的真核表达中,构建了p F-ph-VP1-p10-e GFP重组质粒,使用本实验室在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统上改造的asd缺失型r Sw106-inv菌株,并通过Tn7零背景转座,成功获得Ac Sw106-ph-VP1-p10-GFP重组菌株和Bm Sw106-ph-VP1-p10-GFP重组菌株;通过分别对Sf9细胞和Bm N细胞的侵染,成功构建了Ac BV-ph-VP1-p10-GFP重组杆状病毒和Bm BV-ph-VP1-p10-GFP重组杆状病毒,通过Ac BV-ph-VP1-p10-GFP重组杆状病毒对Sf9细胞的感染,在Sf9细胞中可检测出可溶性重组VP1-6×His蛋白的表达;通过Bm BV-ph-VP1-p10-GFP重组杆状病毒对Bm N细胞和家蚕幼虫感染,在Bm N细胞和家蚕幼虫中均可检测出可溶性重组VP1-6×His蛋白的表达。该研究通过原核表达系统诱导表达了重组VP1-6×His蛋白,其主要以包涵体的形式存在于样品中,通过优化变性与复性的工艺可使其实现增溶,并通过镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的可溶性重组VP1-6×His蛋白样品。为后续生产亚单位疫苗和相关的科研工作提供了理论基础和实践基础,具有一定的实际意义。同时,本研究还提供了一个全新的方法,使用asd缺失型r Sw106-inv菌株与Tn7零背景转座技术,配合家蚕生物反应器,可直接表达出重组VP1-6×His蛋白。其具有高效、低成本和易操作等优点,可作为FMVD-VP1蛋白生产与科研相关方面可能的改进替代方案。
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