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促炎细胞因子在坐骨神经慢性压迫损伤性痛的发病中起着重要作用。白介素10（IL-10）是重要的抗炎细胞因子，对促炎细胞因子有广泛的抑制作用，对多种原因引起的神经病理性痛有预防和治疗作用。但是，IL-10半衰期短，需反复持续用药才足以维持有效治疗浓度。因此，如何使IL-10的治疗作用持久，疗效更理想，需进一步深入研究。本研究探索IL-10的高效真核表达质粒pcDNA3.1-IL-10对大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛的持续治疗效果。实验分为三部分： 第一部分 IL-10真核表达质粒的构建 目的：构建一个具有生物活性的IL-10真核表达质粒。拟解决三个问题：（1）选择合适的信号肽基因和真核表达质粒；（2）正确构建IL-10真核表达质粒；（3）大量制备IL-10真核表达质粒以用于体内外转染研究。 方法：通过两步PCR反应，从原核质粒pUC-19-IL-10上得到IL-10cDNA，并在IL-10cDNA N端加上人单核细胞化学趋化蛋白Ⅰ的信号肽基因。回收PCR产物并经T4DNA连接酶克隆至pUC-T载体，然后经HindⅢ、EcoRⅠ酶切，再通过T4DNA连接酶，将IL-10cDNA克隆至pcDNA3.1质粒，构建成IL-10真核表达质粒pcDNA3.1-IL-10。经酶切鉴定和DNA测序判断已构建的质粒是否正确。 结果：pcDNA3.1-IL-10酶切鉴定的电泳结果显示，pcDNA3.1-IL-10质粒有一个560bp左右的插入片断，大小和IL-10cDNA大致符合。测序结果显示，pcDNA3.1-IL-10上插入片段的序列与人IL-10基因序列完全一致，加上的信号肽基因序列与人单核细胞趋化蛋白Ⅰ的基因序列完全相同。另外，该基因两端有起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA），并有HindⅢ和EcoRⅠ的酶切位点。 结论：本实验通过两步PCR方法将人单核细胞化学趋化蛋白Ⅰ的信号肽基因序列加到IL-10cDNA，再通过酶切、连接等技术，成功构建了含信号肽的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-10。白介素10基因治疗大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛的实验研究第二部分pcDNA3.1一工L一10体外转染培养细胞的实验研究 目的:探讨peDNA3.1一IL一10在上皮样细胞ECV3O4、巨噬细胞RAW264.7和脊髓星形胶质细胞中表达IL一10的能力，以及其对脊髓星形胶质细胞产生促炎细胞因子的影响，以验证pcDNA3.1一工L一10转染这些细胞后产生工L一10的能力及其生物学活性，为应用该质粒治疗大鼠坐骨神经痛的实验研究作准备。 方法:（1）于6孔培养板中培养星形胶质细胞、ECV304细胞、RAW264.7细胞，至细胞长满板底60%时，分别进行pcDNA3.1一工L一10/SA脂质体复合物和pcDNA3.1/SA脂质体复合物转染，第2d后搜集上清液和细胞，分别通过ELISA法和RT一PCR法测定工L一10含量和mRNA的表达。（2）于6孔培养板中培养星形胶质细胞，至细胞长满板底60%时，进行pcDNA3.1一儿一10/SA脂质体复合物和pcDNA3.1/SA脂质体复合物转染，以后每d取上清液共10d，通过ELISA法测工L一10含量。（3）于6孔培养板中培养星形胶质细胞，至细胞长满板底60%时，进行pcDNA3.1一工L一10/SA脂质体复合物和pCDNA3.1/SA脂质体复合物转染，并于培养液中加LPSIOmg/L以刺激星形胶质细胞产生TNFa，每d取上清液共3d，通过ELISA法测IL一10含量，以细胞毒性法测上清液中的TNFQ含量。 结果:（l）三种细胞分别转染pcDNA3.1一工L一10后第2d，培养液上清内IL一10含量均较pcDNA3.1对照组（工L一10蛋白浓度均在IO0pg/m1以下，为假阳性结果）显著增多（p均<0.01）;细胞中可以检测到IL一IOmRNA，而对照组未能检测到工L一IOmRNA。（2）pcDNA3.1一IL一10基因转染星形胶质细胞后第1d到第8d，在培养液上清中检测到较高浓度的工L一10，以第2d量最高。（3）用 LPS活化星形胶质细胞，上清中TNFa含量在第ld时显著增加，以后逐渐降低，至第3d时已降至活化前水平。pcDNA3.1一工L一10显著抑制活化星形胶质细胞产生TNFQ。 结论:peDNA3.l一IL一10在星形胶质细胞、ECV3O4细胞、AW264.7细胞中具有较强的表达工L一10的能力;其转染星形胶质细胞后可以长时间分泌工L一10;pcDNA3.1一工L一10显著抑制活化星形胶质细胞产生促炎细胞因子;sA脂质体在体外具有很强的传递基因的能力。自介素10基因治疗大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛的实验研究第三部分白介素10基因治疗大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛的实验研究 目的:观察PcDNA3.1一工L一10对大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛的治疗效果。本研究拟解决的问题:（1）建立大鼠坐骨神经慢性压迫损伤性痛模型;（2）探讨pcDNA3.1一工L一10在坐骨神经、腰段脊髓、海马、血浆等组织的表达情况;（3）探讨pcONA3.1一IL一10对坐骨神经、腰段脊髓、海马等组织TNFQ的影响;（4）探讨pcDNA3.1一工L一10对坐骨神经慢性压迫损伤性痛大鼠行为学的影响。 方法:大鼠坐骨神经结扎后3d出现热痛觉过敏的动物，随机分为基因治疗组（peDNA3.1一IL一10）、真核表达载体对照组（peDNA3.1）、生理盐水对照组（NS）和CCI对照组（C Cl）（n均为12），前3组分别经蛛网膜下腔注射peDNA3.1一IL一10/SA脂质体复合物、pcDNA3.l/SA脂质体复合物或生理盐水30pL。假手术对照组（Sham）仅暴露坐骨神经而不结扎。以RT一PCR法检测用药后第3d坐骨神经、腰段脊髓、海马组织