论文部分内容阅读
目的:在细胞水平研究ARK5与胃癌多药耐药的关系,明确沉默ARK5基因能否有效逆转胃癌多药耐药细胞SGC7901/DDP的耐药性。方法:1.设计针对ARK5基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列及阴性对照(negative control,NC)序列,并已完成对LV-ARK5-RNAi重组慢病毒载体和阴性重组慢病毒载体的构建;2.用带荧光(GFP)的阴性重组慢病毒载体感染SGC7901/DDP细胞,通过在荧光倒置显微镜下观察来挑选出最优的感染条件;3.采用Western Blot技术测定ARK5在SGC7901细胞和顺铂(DDP)诱导的SGC7901/DDP细胞中的蛋白表达量,并验证构建的慢病毒对ARK5靶点的干扰效率;4.用顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、多西他赛(DR)、阿霉素(ADR)四种结构和机制各异的抗肿瘤药物分别处理SGC7901、SGC7901/DDP、ARK5慢病毒感染组细胞SGC7901/DDP-shARK5、阴性病毒感染组SGC7901/DDPNC,经CCK8、克隆形成实验、流式细胞仪的检测其变化,观察沉默ARK5基因对SGC7901/DDP细胞药物抗性的影响。5.利用流式细胞仪分别测算SGC7901细胞、SGC7901/DDP细胞、SGC7901/DDP-shARK5细胞和SGC7901/DDP-NC细胞对阿霉素的蓄积与滁留,来观察沉默ARK5靶点对SGC7901/DDP细胞的药物主动泵出能力的影响。结果:1.病毒感染的预实验结果:LV-ARK5-RNAi重组慢病毒转染的最优条件为,复感染指数MOI为20,感染体系为含有10%FBS的1640低糖培养基+HiTransG A,感染时间为72 h;2.Western Blot结果显示:胃癌SGC7901/DDP细胞内ARK5蛋白的水平远高于亲本细胞SGC7901;LV-ARK5-RNAi重组慢病毒载体能有效降低SGC7901/DDP细胞内ARK5蛋白的表达量;而予以阴性重组慢病毒转染SGC7901/DDP细胞,其ARK5蛋白的表达水平无明显改变。3.经DDP、5-Fu、ADR和DR四种抗肿瘤药物处理后,在细胞的存活率、对抗肿瘤药物IC50的浓度、细胞克隆形成数目及细胞凋亡指数的方面,ARK5高表达的SGC7901/DDP细胞均远远高于ARK5低表达的SGC7901细胞;沉默ARK5基因后,ARK5慢病毒感染组细胞SGC7901/DDP-shARK5与胃癌多药耐药细胞SGC7901/DDP相比,其细胞存活率显著下降、对化疗药物IC50的浓度显著降低、细胞克隆形成数目显著减少及细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意(p<0.01)。4.ARK5高表达的SGC7901/DDP细胞对阿霉素的药物泵出率远远高于SGC7901细胞;沉默ARK5基因后,ARK5慢病毒感染组细胞SGC7901/DDPshARK5与胃癌多药耐药细胞SGC7901/DDP相比,其对阿霉素的药物泵出率明显降低。结论ARK5基因沉默后,胃癌多药耐药细胞SGC7901/DDP对抗肿瘤药物的抗性显著下降,提示ARK5在胃癌MDR的产生过程中发挥着关键作用;沉默ARK5的基因表达能有效逆转胃癌多药耐药细胞SGC7901/DDP的药物抗性,其作用机制可能与干扰ARK5蛋白的表达能促进胃癌多药耐药细胞的凋亡和抑制其对抗肿瘤药物的主动外排能力有关。