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目的: 观察三物白散对体外经TGF-β1诱导后A549细胞的增殖抑制作用、不同时间点三物白散对其细胞上清液分泌的IFN-r、IL-4、VEGF水平的影响以及a-SMA、E-cad、MAPK家族P38MAPK和P-P38MAPK蛋白表达的影响,探讨在三物白散干预下可能对TGFβ1-EMT进程中的作用机制,从而研究三物白散与肺间质纤维化(PF)的关系,为PF的中医临床治疗提供新的思路和切入点。 方法: 对无血清培养基饥饿过夜后、生长状态良好的A549细胞随机分为7组:取1组作为空白组加入6ml完全培养液,1组加入TGF-β1至完全培养液中(TGF-β1终浓度为5ng/ml)作为模型组,其余5组药物组分别为SWB极低、低、中、高剂量组(SWB药液终分别为10-6、10-5、10-4、10-3g/ml)和西药组。 ①采用MTT法检测不同浓度的三物白散对TGF-β1诱导的A549细胞在24、48、72h时的增殖抑制作用,选取合适药物浓度、药物作用时间。 ②借助显微镜观察24、48h时各组A549细胞形态的改变。 ③采用ELISA法于24、48h两个时间点,检测各组细胞上清液中VEGF、IL-4、IFN-r的分泌表达水平。 ④选用weaern-blot法检测24h、48h时各组E-cad、a-SMA、P38MAPK和P-P38MAPK的蛋白表达情况。 结果: 三物白散对体外经TGF-β1诱导后A549细胞的增殖抑制作用:24h时,三物白散的高、中剂量组对经TGF-β1诱导的A549细胞有抑制作用,且药物对细胞的抑制率与药物浓度呈正比的关系,高剂量组的抑制率为23.68%;48h时,三物白散设定的四个浓度对细胞的抑制率相较于模型组都有明显的抑制作用,呈抛物线趋势,其中,中剂量组的抑制率最高达到了33.4%;72h时三物白散各药物浓度对细胞的抑制率与48h时药物抑制趋势一致但均低于48h的各对应组。 显微镜下观察A549在TGF-β1的作用下,细胞形态由原先鹅卵石状向条梭放射状转变,并在48h时相对于24h时A549细胞的条梭状改变更为明显。 ELISA结果显示:VEGF、IL-4在模型组细胞上清液中的表达较相应的空白组均显著上升,IFN-r的表达明显下降;药物组VEGF、IL-4在细胞上清液中含量与相应模型组相比,皆有不同程度的下调,药物组IFN-r在细胞上清中的表达量与其同时间点模型组的含量相比,显著增高,其差别具有统计性意义。其中高、中剂量组的药效作用要略优于低剂量组,但高、中剂量组的组间差异不明显。 western-blot法检测结果显示:A549经TGF-β1刺激24h、48h后(与空白组相比),a-SMA、P-P38MAPK表达明显增加;E-cad表达下调;P38MAPK蛋白表达变化不明显。经三物白散干预之后与相应模型组相比,药物组a-SMA、P-P38MAPK的表达量均有程度不同的下调,E-cad蛋白相应表达增加,其差别具有统计学意义;药物组P38MAPK蛋白表达较模型组有一定下调趋势,但仅在24h高剂量组,48h中剂量组蛋白下调量有统计学意义。 结论: ①TGF-β1可诱导A549细胞向间充质细胞转分化。 ②48小时时,中剂量组三物白散对经TGF-β1诱导下A549细胞的增殖抑制率最明显。 ③三物白散可能通过调节经TGF-β1诱导的A549细胞EMT体外模型中细胞因子IFN-r、IL-4、VEGF的浓度表达水平而起到抑制肺纤维化病情进程的作用。 ④三物白散可通过下调a-SMA、P-P38MAPK蛋白的表达,上调E-cad蛋白,发挥抑制肺泡上皮细胞EMT转分化的进程而具有一定抗纤维化的效用。