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包虫病又称棘球蚴病,是由细粒棘球绦虫中绦期幼虫寄生于人及家畜而引起的一种人兽共患寄生虫病。该病已成为全球性的公共卫生问题,我国是主要流行国家之一。控制包虫病最理想的方法是疫苗免疫接种,动物实验证实Eg95诱导绵羊抗六钩蚴感染的保护率在90%以上。目的:克隆Eg95基因至pET30a质粒,在大肠杆菌中表达Eg95蛋白;构建并鉴定重组BCG-Eg95。方法:(1)将Eg95目的片段和质粒pET30a分别用EcoⅠ/Hind Ⅲ及Nde Ⅰ/Hind Ⅲ限制酶消化,酶切产物T4DNA连接酶连接过夜;连接产物转化E.coli.DH5α后进行阳性克隆筛选、菌液PCR、质粒双酶切和测序鉴定;构建成功的重组子转化E.coli.BL21,IPTG诱导其表达,表达蛋白纯化;(2)将Eg95目的片段和质粒pMV261分别用EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ限制酶消化,酶切产物T4DNA连接酶连接过夜;连接产物转化E.coli.DH5α后进行阳性克隆筛选、菌液PCR、质粒双酶切和测序鉴定;用电穿孔法将重组质粒导入BCG感受态细胞,重组菌进行阳性克隆筛选、抗酸染色、PCR鉴定;重组菌热诱导培养。结果:(1)1%琼脂糖凝胶电泳显示菌液PCR产物为一约500bp大小的片段,测序结果证实pET30a质粒中插入一 471bp的外源基因,Blast比对发现该基因与Genbank中AY421719序列完全一致,证明Eg95基因正确插入载体pET30a中;重组质粒转化E.coli.BL21,诱导结果表明IPTG不能诱导Eg95表达,可能是由于外源蛋白起始密码子在大肠杆菌表达系统中不能被有效利用,诱导His-Eg95表达的最佳条件为0.05mM IPTG,25℃诱导6h;融合蛋白经Ni-NTA柱层析纯化后纯度明显提高;(2)测序结果证实Eg95正确插入载体平pMV261中,阳性克隆筛选、PCR结果证实重组质粒成功转化BCG,重组菌热诱导后表达一 18kDa大小的外源蛋白。结论:(1)利用大肠杆菌pET表达系统成功表达融合6个His标签的Eg95蛋白,证实该蛋白主要以可溶性形式存在。(2)成功制备重组BCG-Eg95。