研究背景和目的糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌缺陷或/和胰岛素抵抗所引起的以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,其发病率呈逐年递增趋势,严重危及人类健康。目前临床上常用的糖尿病治疗药物存在诸多不良反应或/和长期疗效差等问题。因此,开发更加安全有效的新型药物对满足当前糖尿病治疗的临床需求具有重要意义。天然化合物齐墩果酸(OA)具有降糖、降脂、保肝、抗炎等多种药理活性,其降糖作用与促进肠促胰素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌有关。但是OA的体内降糖作用较弱,并存在潜在的肝毒性,限制了其在糖尿病治疗中的应用。DKS26是一种新的齐墩果酸衍生物,本论文系统研究其体内外抗糖尿病作用,同时考察它对糖尿病小鼠的肝保护作用,以及对正常小鼠的用药安全性;论文还针对DKS26的促GLP-1分泌作用,进一步探讨其潜在的抗糖尿病分子作用机制,为其开发成新型糖尿病治疗药物提供实验依据和理论指导。研究方法1.DKS26的体外药效学研究(1)DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响采用葡萄糖氧化酶法检测DKS26对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。试验分组为:溶剂对照组、二甲双胍1mM阳性对照组、OA0.1μM、1μM、10μM对照组和 DKS26 0.1 μM、1 μM、10μM受试组。(2)DKS26对游离脂肪酸(FFAs)诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响采用甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒和油红O染色法检测DKS26对FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响。试验分组为:正常对照组、FFAs 0.25 mM模型对照组、苯扎贝特10 μM阳性对照组、二甲双胍1 mM对照组、OA 10 μ对照组和DKS26 10 μM受试组。2.DKS26的体内药效学研究(1)DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响ICR小鼠经腹腔注射130 mg/kg STZ诱导糖尿病模型(空腹血糖≥11.1 mmol/L)。糖尿病小鼠按血糖值大小随机分为4组,分别为STZ模型对照组(n=7)、二甲双胍 100 mg/kg 阳性对照组(n=8)、OA100 mg/kg 对照组(n=8)和 DKS26 100 mg/kg受试组(n=8)。同时另设正常小鼠对照组(n=5),与STZ模型对照组同样给予与给药组等体积的0.5%CMC-Na。连续灌胃给药33天,观察DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量(OGT)、饮水量、摄食量和体重的影响。末次给药后,检测DKS26对小鼠血浆糖化血清蛋白(GSP)、胰岛素、TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、直接胆红素(D-BIL)和总胆红素(T-BIL)水平的影响;采用HE染色法观察小鼠胰岛和肝脏组织病理形态学的变化;采用TG、TC试剂盒检测及油红O染色法观察小鼠肝脏脂质蓄积的变化;采用RT-PCR法检测小鼠肝脏炎症相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、CD68和F4/80)表达的变化;采用游标卡尺法、称重法测定小鼠胆囊大小的变化。(2)DKS26对db/db糖尿病小鼠的影响db/db小鼠(空腹血糖≥11.1 mmol/L)按血糖随机分为4组,每组7-8只,分别为db/db模型对照组(0.5%CMC-Na)、二甲双胍100 mg/kg阳性对照组、OA 100 mg/kg对照组和DKS26 100 mg/kg受试组。连续灌胃给药30天,观察DKS26对db/db小鼠空腹及随机血糖、OGT、饮水量、摄食量和体重的影响。末次给药后,检测DKS26对小鼠血浆GSP、胰岛素、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、ALP、TBA、D-BIL 和 T-BIL 水平的影响;同时考察其对小鼠胰岛和肝脏组织病理形态学、肝脏脂质蓄积、肝脏炎症和胆囊大小的影响。3.DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究(1)DKS26对GLP-1表达与分泌的影响采用ELISA法,观察DKS26对肠道内分泌NCI-H716细胞培养上清液和上述两种糖尿病小鼠血浆GLP-1水平的影响。分别采用免疫荧光法、RT-PCR法、ELIS A法和Western Blot法,观察DKS26对NCI-H716细胞和小鼠肠道组织GLP-1蛋白原位表达、GLP-1相关基因(gcg和PC3)表达、cAMP含量和p-PKA及PKA蛋白表达的影响。(2)DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响采用体外报告基因系统筛选模型HEK293/pGL4.29/hTGR5细胞检测DKS26对人源TGR5(hTGR5)的影响。分组为:空白对照组、INT-777阳性对照组、OA对照组和DKS26受试组。(3)DKS26对肝脏AMPK蛋白和糖脂代谢相关基因表达的影响采用Western Blot法观察DKS26对正常HepG2细胞、FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞和上述两种糖尿病小鼠肝组织蛋白p-AMPK、AMPK、p-ACC和ACC表达的影响;采用RT-PCR法检测DKS26对肝细胞和糖尿病小鼠肝组织糖脂代谢相关基因 G6Pse、PEPCK、GLUT2、SREPB-1c、FAS、PPARα和 CPT1 表达的影响。4.DKS26对正常小鼠肝功能的影响DKS26对正常ICR小鼠连续给药后,观察小鼠血浆ALT、AST、TBA水平的变化,以考察其对正常小鼠肝功能的影响。分组为:溶剂对照组0.5%CMC-Na、二甲双胍100mg/kg对照组、OA100mg/kg对照组和DKS26 100mg/kg受试组。研究结果1.DKS26的体外药效学研究(1)DKS26对人肝HepG2细胞葡萄糖消耗的影响DKS26可明显增加肝HepG2细胞葡萄糖消耗,该作用与阳性对照药二甲双胍相当。(2)DKS26对FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞脂质水平的影响DKS26可降低FFAs诱导脂质蓄积肝HepG2细胞TG、TC水平,并减少细胞内脂滴含量。2.DKS26的体内药效学研究(1)DKS26对STZ诱发糖尿病小鼠的影响DKS26可明显降低STZ诱发糖尿病小鼠血浆葡萄糖、GSP和脂质水平,改善OGT,并减少饮水量、摄食量,其降血糖作用与二甲双胍相当,明显强于OA;它可增加血浆胰岛素水平和改善胰岛组织形态;还可降低血浆ALT、AST和ALP水平,减少肝脏脂质水平,改善肝脏组织病理形态和抑制肝脏炎症相关基因表达。此外,DKS26可降低小鼠血浆D-BIL和T-BIL水平以及D-BIL/T-BIL比值,降低血浆TBA,同时可缩小模型小鼠增大的胆囊。(2)DKS26对db/db糖尿病小鼠的影响DKS26可明显降低db/db小鼠血浆葡萄糖、GSP和脂质水平,改善OGT,减少饮水量,其降糖和改善OGT的作用与二甲双胍相当,明显强于OA;它可增加血浆胰岛素水平,改善胰岛组织形态;还可降低血浆ALT、AST和ALP水平,减少肝脏脂质水平,改善肝脏组织病理形态和抑制肝脏炎症相关基因的表达。此外,DKS26对小鼠血浆TBA水平和胆囊大小无明显影响;对血浆D-BIL和T-BIL虽有降低作用,但对二者的比值无明显影响。3.DKS26的抗糖尿病分子作用机制研究(1)DKS26对GLP-1表达与分泌的影响DKS26可增加NCI-H716细胞上清液中GLP-1含量,增加细胞内GLP-1蛋白和GLP-1相关基因(gcg和PC3)的表达,并升高细胞内cAMP和p-PKA蛋白的水平。它也可增加STZ诱发糖尿病小鼠和db/db小鼠血浆GLP-1水平,促进肠道gcg和PC3的表达,同时升高肠道内cAMP和p-PKA蛋白的水平,此外还可增加STZ诱发糖尿病小鼠肠道GLP-1蛋白的原位表达。(2)DKS26对人源G蛋白偶联胆汁酸膜受体(TGR5)的影响DKS26在最高浓度100μ时对hTGR5仍无激动效应,而OA对hTGR5具有较弱的激动效应(OAEC50=13.659±1.812 μM,阳性对照化合物INT-777 EC50=1.765±0.452 μM)。(3)DKS26对肝脏AMPK蛋白表达和糖脂代谢相关基因表达的影响在体外,DKS26可增加正常肝HepG2细胞磷酸化蛋白p-AMPK及其下游靶蛋白p-ACC的表达,该作用具有浓度和时间依赖性,伴随着糖异生关键酶G6Pase、PEPCK表达的减少和葡萄糖转运体GLUT2表达的增加;它还可逆转FFAs诱导脂质蓄积HepG2细胞降低的p-AMPK和p-ACC的表达,伴随着脂肪合成相关的SREPB-1c、FAS表达的抑制和脂肪分解相关的PPARα、CPT1表达的提高。在体内,DKS26可上调STZ诱发糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠肝组织p-AMPK和p-ACC的蛋白表达,伴随着基因水平G6Pαse、PEPCK表达的减少和GLUT2表达的增加,以及SREPB-Ic、FAS表达的抑制和PPARα、CPT1表达的增加。4.DKS26对正常小鼠肝功能的影响DKS26连续给药对正常小鼠血浆ALT、AST和TBA水平均无明显影响,但相同剂量的OA可增高这些肝功能损伤相关指标的血浆水平。结论齐墩果酸衍生物DKS26在体内外均具有良好的抗糖尿病作用,其作用机制可能与激活肠道cAMP/PKA信号通路促进GLP-1分泌与表达有关,也可能与激活肝脏AMPK信号通路调节糖脂代谢有关。此外,DKS26对糖尿病小鼠具有肝保护作用,其用药安全性高于齐墩果酸。1 · DKS26可增加人肝HepG2细胞葡萄糖消耗,减少FFAs诱导脂质蓄积肝HepG2细胞内脂质水平,其作用机制可能与激活肝AMPK信号通路,下调PEPCK和G6Pase表达、上调GLUT2表达从而降低糖异生、增加糖摄取,以及抑制SREBP-1c和FAS表达、增加PPARα和CPT1表达从而抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化有关。2.DKS26连续给药33天可降低STZ诱发糖尿病小鼠的空腹血糖和血脂水平,改善OGT,其降血糖作用与二甲双胍相当,强于OA;可减少饮水量、摄食量改善糖尿病小鼠多饮、多食的症状;可增加血浆胰岛素水平,改善胰岛组织形态发挥胰岛保护作用;可改善肝功能、肝脏组织病理形态、肝脏脂质蓄积和肝脏炎症状态发挥护肝作用。此外,DKS26可降低小鼠血浆TBA水平,减小胆囊,提示其对STZ诱发的糖尿病小鼠用药无胆汁淤积与胆囊充盈的风险。3.DKS26连续给药30天可降低db/db糖尿病小鼠的空腹、随机血糖和血脂水平,其降血糖作用与二甲双胍相当,强于OA;可改善OGT,该作用优于OA;可降低饮水量改善糖尿病小鼠多饮的症状;可增加血浆胰岛素水平,改善胰岛组织形态发挥胰岛保护作用;可改善肝功能、肝脏组织病理形态、肝脏脂质蓄积和肝脏炎症状态发挥护肝作用。此外,DKS26对血浆TBA水平和胆囊大小无明显影响,提示其对db/db糖尿病小鼠用药诱发胆汁酸淤积与胆囊充盈的风险较低。4.DKS26可促进肠道内分泌NCI-H716细胞GLP-1的表达与分泌,其作用机制可能与激活cAMP/PKA信号通路有关。DKS26可增加STZ诱发糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠血浆GLP-1水平,促进肠道GLP-1蛋白和相关基因(gcg和PC3)的表达,并激活肠道cAMP/PKA信号通路,表明其降血糖、降血脂和胰岛保护的作用机制可能与促GLP-1分泌与表达有关。5.DKS26可激活STZ诱发糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠肝脏的AMPK信号通路,同时可抑制肝脏PEPCK、G6Pase、SREBP-1c和FAS的表达,并促进GLLUT2、PPARα和CPT1的表达,表明其降血糖、降血脂的作用机制可能与激活肝脏的AMPK信号通路,调节与糖脂代谢相关的酶与核转录因子,进而抑制糖异生和脂肪酸合成,并促进糖摄取和脂肪酸氧化有关。6.DKS26对正常小鼠的肝功能无明显影响,而OA可损伤小鼠的肝功能,提示DKS26的用药安全性高于OA。