目的: 1 型糖尿病是在多基因遗传基础上由环境因素触发的自身免疫性疾病。其发病时往往90%以上的胰岛β细胞已遭破坏,患者须终身应用胰岛素治疗,如剂量不当易发生低血糖或酮症酸中毒,其心、脑、肾慢性并发症也给病人带来极大的痛苦,甚而威胁生命。因此,选择药物对 1 型糖尿病进行免疫干预并深入探讨其作用机理具有重要的理论意义和临床实用价值。 1 型糖尿病的发生与自身免疫调节失衡密切相关。当机体对胰岛多种抗原成分失去耐受后,主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子与其处理的β细胞抗原共同激活辅助性 T 淋巴细胞(Th)中的 Th1 亚群,抑制 Th2 亚群,造成 Th1/Th2 型细胞因子的不平衡;进而激活细胞毒性 T 细胞(TCL)、巨噬细胞(MΦ)、自然杀伤细胞(NK),从而产生氧自由基、一氧化氮(NO)、细胞因子(IL-1、TNFα/β、IFN-γ)等,对胰岛β细胞产生直接毒性,导致自身免疫性胰岛炎的发生。 大量研究表明,CD4 辅助性 T 淋巴细胞为 1 型糖尿病的主要免疫介导细 +胞。正常情况下,CD4 Th 细胞处于前体状态,为仅表达少量 IL-2 的 Thp 细 +胞;当特异性抗原刺激抗原提呈细胞后,Thp 细胞被诱导为 Thp 细胞,后者 +迅速分化为 Th0 细胞;Th0 细胞为 Th1 或 Th2 细胞的前体细胞,在 INF-γ的刺激下可分化为 Th1 细胞,在 IL-4 的刺激下,则可分化为 Th2 细胞。Th1 细胞主要分泌 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ 等细胞因子,介导细胞免疫应答,有促进 Th0 细胞分化成熟的功能,又有抑制 Th2 细胞的功能。Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β 等细胞因子,介导体液免疫,有抑制 Th1 细胞的功能。两类细胞通过自身或其它免疫细胞分泌的细胞因子进行交叉调节、相互抑制,维持着机体的自身免疫平衡。 研究表明,Th1 细胞及其细胞因子对 1 型糖尿病有促进作用,而 Th2 型细胞/细胞因子则对胰岛β细胞起保护作用。1 型糖尿病的发生与 Th1 亚群过度活化及 Th2 亚群相应抑制所导致的免疫失平衡状态密切相关。近年来,国内外学者尝试在1型糖尿病的发病前期应用免疫干预以阻止胰岛的自身免疫反应,并已成为当今研究的一大热点。 目前常用的 1 型糖尿病免疫干预制剂有以下几类:① 促进免疫反应由Th1 型向 Th2 型转化,如谷氨酸脱羧酶、热休克蛋白、弗氏佐剂、卡介苗、双羟维生素 D3、胰岛素样生长因子-1、抗白介素-12 抗体、磷酸二酯酶抑制 1<WP=5>剂等;② 抑制 T 细胞对抗原的识别,如抗 CD3 抗体,抗 CD4 抗体等;③ 抑制胰岛细胞凋亡,如尼克酰胺,FasL,低剂量γ-射线辐照等;④ 基因免疫治疗,即将有免疫保护作用的基因(如 IL-4,IL-10,IL-12)导入到胰岛表达。近年来,中草药的降糖作用已越来越引起人们的重视,其可能的降糖成分包括多糖、生物碱、黄酮、皂甙等类型,多糖为其中比重最大的一类。黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide,简称 APS)是黄芪提取液中的均一多糖部分,为黄芪主要的活性成分之一,由 APSⅠ、Ⅱ组成。APSⅠ是杂多糖,由 D-葡萄糖、D-半乳糖和 L-阿拉伯糖组成;APSⅡ为葡聚糖,由α-(1→4)-D-糖苷键连接而成。已有研究表明,APS 是一种有效的免疫调节剂,对机体细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫及细胞因子的活性均有调节作用;本课题的前期研究发现,APS 能降低 STZ 糖尿病大鼠的血糖水平,对糖尿病心肌病变、肾脏病变均有保护作用;然而 APS 对 1 型糖尿病的预防作用及其可能机制的研究在国内外尚无报道。本课题深入研究 APS 对 NOD 小鼠 1 型糖尿病的预防作用,并探讨其对 NOD 小鼠 Th1/Th2 型细胞/细胞因子免疫失衡的重建作用,从而为黄芪多糖用于预防 1 型糖尿病提供实验基础和理论依据。APS因其天然性、低毒性、来源广泛、造价低、制备方便,如能成为 1 型糖尿病的免疫干预制剂,将具有较大的社会意义和经济价值。方法:1. 选取体重 10g～15g 的 4 周龄雌性 NOD 小鼠 40 只,随机分为两组:黄芪 多糖预处理组(APS 组)20 只,生理盐水对照组(NS 组)20 只; 4 周 龄起给予 APS 组 APS 2.0 g/kg/d p.o.×10 周,给予 NS 组等量的生理 盐水;40 周龄时处死小鼠,留取血清、胰腺、脾脏标本。2. 运用生化、RIA、ELISA 方法检测血糖、血清 C-肽和 GAD-Ab 水平。3. 光镜下观察胰岛的组织病理,进行胰岛炎分级计数。4. 电镜下观察胰岛β细胞的超微结构。5. 运用免疫组织化学法分析胰岛浸润 T 淋巴细胞的 CD4 、CD8 亚群。 + +6. 运用流式细胞仪分析脾组织 T 淋巴细胞 CD4 /CD8 亚群比值。 + +7. 抽提两组小鼠每个胰腺的总 RNA,作纯度鉴定。8. 抽取 APS 组每个胰腺样本 10μg 总 RNA,等量混合,作为 APS 组胰腺总 RNA 样本,同法获取对照组胰腺总 RNA 样本;运用基因芯片技术对两组 总 RNA 样本进行检测,用专业软件分析检测结果。9. 运用 RT-PCR 方法检测两组小鼠每个胰腺 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、 TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、TGF-β、B