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杀菌性/通透性增强蛋白（bactericidal/permeability increasing protein,BPI）是存在于人和哺乳动物多形核粒细胞内的一种阳离子抗菌蛋白,在中性粒细胞的诸多抗菌成分中,BPI蛋白是目前发现的唯一能够非特异性杀伤革兰氏阴性菌并中和内毒素,同时具有免疫调节等作用的抗菌物质。本研究以新疆巴什拜羊及其杂交羊为研究对象，应用分子生物学技术克隆BPI基因全长cDNA序列，并进行序列分析，表达并纯化BPI蛋白，并而后通过抑菌试验验证其生物学活性。目的：本研究通过克隆巴什拜羊及其杂交羊的BPI基因cDNA全长序列，对其进行生物信息学分析，通过原核表达巴什拜羊及其杂交羊BPI基因，研究重组BPI蛋白对革兰氏阴性菌的抑菌作用，验证其生物活性，为下一步研究绵羊BPI蛋白的生物学功能奠定基础。方法：（1）巴什拜羊及其杂交羊BPI基因全长cDNA的扩增及序列分析：根据NCBI已报道的牛BPI基因序列，设计兼并引物，克隆获得巴什拜羊及其杂交羊BPI基因片段，通过该片段设计RACE引物，应用RACE技术分别扩增以上两种羊BPI基因的全长cDNA序列，并测序、拼接，最后利用生物学软件对所得BPI全长cDNA序列进行分析。（2）巴什拜羊及杂交羊BPI基因全长cDNA的生物信息学分析：利用在线分析工具对获得的BPI基因序列进行基因结构及理化特性分析，并预测其功能；运用网络数据库及程序，对BPI蛋白进行生物信息学分析。（3）巴什拜羊及杂交羊BPI基因N-端序列的扩增：采集巴什拜羊及杂交羊外周血液，分离中性粒细胞并提取RNA，根据RACE技术得到的BPI cDNA序列设计特异性PCR引物，分别克隆出巴什拜羊及其杂交羊BPI基因N-端序列，回收PCR产物与pMD18-T载体连接后转化感受态细胞DH5α，检测阳性克隆、测序。（4）巴什拜羊及杂交羊BPI基因表达载体的构建及表达：将鉴定正确的巴什拜羊和杂交羊BPI N-端序列连接至pGEX原核表达载体，构建pGEX-BPI表达质粒，转化至感受态细胞BL21（DE3）中，优化诱导表达条件并进行SDS-PAGE分析鉴定。（5）巴什拜羊及杂交羊BPI蛋白的纯化及其生物学活性检测：利用GST树脂纯化方法分别对巴什拜羊及杂交羊重组BPI蛋白进行纯化，SDS-PAGE检测。分别用微量肉汤稀释法和琼脂糖抑菌试验分别检测两种羊重组BPI蛋白的生物学活性。结果与结论：（1）巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长为1922bp，其中开放阅读框1452bp，共编码483个氨基酸，编码区两侧翼分别具有5′-UTR54bp和3′-UTR416bp。BLAST结果表明巴什拜羊BPI与绵羊（预测）、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的核苷酸同源性分别为99%、91%、78%、74%、64%、61%、58%、53%、50%。杂交羊BPI基因cDNA序列全长为1939bp，其中开放阅读框1452bp，共编码483个氨基酸，编码区两侧翼分别具有5′-UTR84bp和3′-UTR403bp。BLAST结果表明杂交羊BPI与绵羊（预测）、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的核苷酸同源性分别为97%、91%、77%、74%、64%、60%、58%、52%、50%。比较巴什拜羊与杂交羊BPI开放阅读框后发现，有11处碱基改变，其中6处碱基的改变使得其编码氨基酸产生差异。（2）巴什拜羊BPI基因ORF中(A+T)含量为45.25%[657],(C+G)含量为4.75%[795]；其杂交羊BPI基因ORF中(A+T)含量为44.97%[653],(C+G)含量为55.03%[799]。两种羊的BPI蛋白均为亲水性蛋白，属于分泌蛋白，主要存在于细胞外基质；巴什拜羊BPI蛋白含有19个α螺旋，18个β折叠，33个转角和无规则卷曲，而杂交羊BPI蛋白含有18个α螺旋。Ｎ端均有信号肽，有BPI1和BPI2两个保守结构域。通过分子进化树研究发现巴什拜羊/杂交羊的BPI基因在绵羊、牛、虎鲸、野猪、人、猕猴、家兔、小鼠、非洲爪蟾中，与绵羊首先聚为一类，后与牛聚为一类，这与动物分类学一致。（3）巴什拜羊及其杂交羊BPI基因N-端序列均为598bp，编码198个氨基酸。经比较两种羊N-端序列序列，发现两者之间共有3处核苷酸差异，杂交羊编码序列第328位，处于密码子第一位的G变为T，导致了氨基酸Gly(甘氨酸)转变为Cys(半胱氨酸)；第449位，处于密码子第二位的T变为G，导致了氨基酸Val(缬氨酸)转变为Gly(甘氨酸)；第660位，处于密码子第二位的A变为G，导致了氨基酸Gln(谷氨酰胺)转变为Arg(精氨酸)。（4）成功构建了巴什拜羊及其杂交羊BPI原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，宿主菌表达出分子量约为45KD的融合蛋白。(5)表达产物纯化后，经SDS-PAGE检测显示，观察到条带单一的目的条带，成功纯化了巴什拜羊及其杂交羊重组BPI蛋白。微量肉汤稀释法结果表明随着蛋白浓度的增大，对大肠杆菌的作用效果增强，且在4h时保持最佳活性；琼脂糖抑菌试验表明巴什拜羊BPI蛋白较杂交羊BPI蛋白抑菌效果更强，且其对大肠杆菌有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌无抑制作用。说明本实验表达的巴什拜羊和杂交羊重组BPI蛋白具有良好生物学活性。