【摘 要】
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α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase,EC3.2.1.20）,也称作α-葡萄糖基转移酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-糖苷键从而释放出葡萄糖,也可以将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6糖苷键,在低聚异麦芽糖生产过程中起着关键作用。柠檬酸是一种重要的多功能有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等领域。但在柠檬酸发酵生产过程中,发酵液残糖含量2%左右,造成原料的极大浪费。残
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α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase,EC3.2.1.20）,也称作α-葡萄糖基转移酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-糖苷键从而释放出葡萄糖,也可以将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6糖苷键,在低聚异麦芽糖生产过程中起着关键作用。柠檬酸是一种重要的多功能有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等领域。但在柠檬酸发酵生产过程中,发酵液残糖含量2%左右,造成原料的极大浪费。残糖主要成分为低聚异麦芽糖,其主要是由α-葡萄糖苷酶的催化形成的。因此,在柠檬酸发酵过程中,α-葡萄糖苷酶是决定残糖形成的关键酶之一。本研究通过分析产柠檬酸黑曲霉基因组序列,分析其中可能的α-葡萄糖苷酶基因并进行基因表达和酶学性质研究,为降低残糖含量,提高糖类的利用率和柠檬酸的产量做准备。根据NCBI中已知的α-葡萄糖苷酶基因序列并结合表达载体p PIC9K及p YPGE15的特点,采用引物设计软件设计特异性引物。通过PCR方法从黑曲霉c DNA中扩增出预期大小的特异性产物。将目的基因片段和表达载体双酶切后用连接酶连接并转化到大肠杆菌感受态细胞中,获得重组子。该重组子经过酶切验证,初步证实α-葡萄糖苷酶基因的克隆是正确的。重组子送金唯智公司测序。将质粒线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选出正确的高拷贝阳性克隆后在BMD培养基中发酵表达。将质粒电转酿酒酵母W303-1B细胞,筛选出正确的阳性克隆后在YPD培养基中发酵表达。基因119858及214233成功在两个酵母表达系统中表达且具有活性。研究重组α-葡萄糖苷酶的酶学性质,发现重组α-葡萄糖苷酶119858-GS115,119858-W303-1B,214233-GS115,214233-W303-1B均属于酸性酶,重组α-葡萄糖苷酶119858-GS115的最适p H为6,最适温度70℃,在40℃-60℃范围内具有较强的热稳定性,在p H5-7范围内具有较好的p H稳定性;重组α-葡萄糖苷酶119858-W303-1B的最适p H为5,最适温度60℃,在40℃-60℃范围内具有较强的热稳定性,在p H4-7范围内具有较好的p H稳定性;重组α-葡萄糖苷酶214233的最适p H均为4,214233-GS115最适温度为70℃,在30℃-55℃范围内具有较强的热稳定性,在p H3-8范围内具有较好的p H稳定性;214233-W303-1B最适催化温度为70℃,在30℃-50℃范围内具有较强的热稳定性,在p H3-7范围内具有较好的p H稳定性。金属离子对重组α-葡萄糖苷酶的酶活影响不大,只有钡离子和锰离子对119858-W303-1B有强抑制作用。相较于重组α-葡萄糖苷酶119858,重组α-葡萄糖苷酶214233对底物p NPG的亲和力更强。以麦芽糖为底物,研究重组α-葡萄糖苷酶的转苷活性,发现重组α-葡萄糖苷酶119858可能有转苷活性,重组α-葡萄糖苷酶214233有转苷活性,重组α-葡萄糖苷酶214233-GS115最适转苷p H为6,反应30h后转苷率为48.92%。
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