前额叶皮层(Prefrontal cortex)在逻辑推理、行为抑制、灵活性学习、工作记忆以及注意力调节等脑的高级功能中起重要作用。该部位的损伤与精神分裂症、帕金森病、注意力损伤多动症等许多神经、精神以及心理疾病有关。N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspatate receptor, NMDAR)是一类兴奋性氨基酸受体,对神经系统发育和生理功能具有重要作用。NMDA受体是由NR1、NR2 (A,B,C,D)和NR3 (A,B)亚基构成的异聚性复合体,NR1是脑内NMDA受体共有的亚基,NR2亚基的不同组成是影响其功能的决定因素。同海马区相似,前额叶区NMDA受体主要由NR1、NR2A和NR2B亚基组成,但关于NMDA受体及亚基在前额叶区突触可塑性及相关神经功能中作用的研究却较少。药理学研究表明：前额叶脑区注射NMDA受体拮抗剂phencyclidine (PCP),可以诱导小鼠精神分裂症样行为,并造成相关工作记忆的损伤；进一步研究发现,幼年期开始慢性腹腔注射PCP,有精神分裂样行为表现,并且前额叶区突触膜上和内质网内NR2A亚基的表达量增加,。由此推测NR2A亚基在前额叶相关认知功能中具有重要作用并与精神分裂症有密切关系。来自NR2A亚基敲除小鼠的研究显示,小鼠工作记忆受损,海马长时程增强(long-term potential, LTP)减弱,并表现出焦虑样行为。那么,NR2A亚基过量表达,前额叶突触可塑性会发生哪些改变?前额叶脑区相关功能会有哪些变化?我们采用NR2A转基因小鼠,将分子生物学、免疫组织化学、离体脑片电生理技术与整体行为学技术相结合,从分子、细胞突触和整体不同水平研究NR2A亚基在前额叶区过量表达对于小鼠前额叶突触可塑性和前额叶相关功能的影响。1.NR2A转基因小鼠前额叶区NR2A表达的研究NR2A转基因小鼠是采用α钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(αCaM-Kinase-Ⅱ)作为启动子创建的。我们通过Realtime-PCR、Western-blot、免疫组化等技术分别从RNA和蛋白水平上检测3月龄转基因小鼠前额叶区NR2A的表达及分布状况。1) Realtime-PCR结果显示：转基因小鼠前额叶区NR2A的RNA表达量约为同窝对照组小鼠的2.7倍,而NR1、NR2B表达则无明显变化；2) Western-blot结果显示：转基因小鼠前额叶脑区NR2A亚基的蛋白表达量约为同窝对照组小鼠的1.54倍,而NR1、NR2B表达则无明显变化；3)免疫组化的实验证实：NR2A亚基确实在前额叶脑区过量表达。以上数据表明,NR2A亚基在NR2A转基因小鼠前额叶脑区过量表达。2.NR2A转基因小鼠前额叶区突触可塑性的研究NMDA受体是电压和配体双重门控离子通道受体,在中枢神经突触可塑性中起着重要作用。长时程增强(Long-term potentiation, LTP)和长时程抑制(Long-term depression, LTD)作为突触可塑性的两种主要形式,被广泛研究。1)前额叶区基本突触传递的研究：记录NR2A转基因小鼠与同窝对照小鼠前额叶区兴奋性突触后电位(Field excited postsynaptic potential, EPSP)的刺激强度-反应曲线(Input-output curve)和双脉冲抑制反应(Paired pulse depression, PPD)。与同窝对照组小鼠相比,NR2A转基因小鼠前额叶区的基本突触传递无明显变化,数据提示NR2A转基因小鼠前额叶区突触前神经元递质释放和突触后AMPA受体(Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid Receptor, AMPAR)功能无显著改变。2)前额叶区LTP/LTD的研究：采用强直刺激和theta-burst刺激,诱导两组小鼠前额叶区LTP。结果显示,NR2A转基因小鼠LTP显著小于同窝对照小鼠。此外,我们采用不同低频刺激,在两组小鼠前额叶诱导LTD。与同窝对照组小鼠相比,NR2A转基因小鼠前额叶区LTD明显受损。使用NR2A亚基的拮抗剂NVP-AAM077,转基因小鼠前额叶区LTD损伤被逆转。结果提示NR2A亚基过量表达损害了NR2A转基因小鼠前额叶区LTP和LTD的诱导。由此我们推测,NR2A亚基过量表达,可能缩短了NMDA受体通道开放时间,减少了NMDA受体通道转运Ca2+离子量,使得前额叶脑区NMDA受体功能减弱,从而导致NR2A转基因小鼠前额叶脑区双向长时程突触可塑性减弱。3.NR2A转基因小鼠精神分裂症样行为的研究本课题采用开场实验(Open field)、前脉冲抑制(Pre-pulse inhibition, PPI)、居留者-入侵者测试(Resident-intruder test)、筑窝实验(Nest building test)等行为学实验,研究NR2A转基因小鼠是否有精神分裂症样行为表现。结果显示：NR2A转基因小鼠基本活动量无显著变化,但是刻板运动的总时间有所增加；与同窝对照组小鼠相比,NR2A转基因小鼠PPI受损、社会性探索时间减少,而且逃避行为增多、筑窝意识淡漠。以上数据提示,NR2A转基因小鼠感觉门控功能异常,并出现社交退缩、筑窝意识淡漠等社会性行为异常,表现出精神分裂症样的阴性症状,使用非典型抗精神药物clozapine则可以部分逆转相关损伤。实验表明NR2A亚基过量表达可能导致转基因小鼠产生精神分裂症样行为。4.NR2A转基因小鼠认知功能的研究NR2A亚基主要在前脑表达,对于学习记忆有重要作用。NR2A亚基敲除小鼠空间工作记忆受损,那么NR2A亚基上调,小鼠认知能力会有哪些变化呢?本课题采用以下行为学实验对NR2A转基因小鼠学习记忆能力进行了研究。1)在新异物体识别任务中,NR2A转基因小鼠探究新物体的时间显著少于同窝对照组小鼠,数据提示NR2A转基因小鼠识别记忆受损：2)在T迷宫实验中,NR2A转基因小鼠准确率低于同窝对照小鼠,表明NR2A转基因小鼠前额叶脑区相关工作记忆明显受损,这一结果与水迷宫工作记忆测试的数据一致；3)在水迷宫反向学习实验中,尽管两组小鼠对于隐藏平台的初次记忆相当,但是在反向学习中,NR2A转基因找到隐藏平台的时间显著增加,表明NR2A转基因小鼠反向学习记忆能力明显受损,灵活性学习能力降低；4)在条件性味觉厌恶测试实验中,NR2A转基因小鼠饮用糖水比率高于同窝对照小鼠；在条件性恐惧记忆测试中,NR2A转基因小鼠的恐惧反应程度较低,表明NR2A转基因小鼠联合性学习记忆能力受损。以上数据提示：前额叶区NR2A亚基的过量表达,使NR2A转基因小鼠前额叶相关的识别记忆、工作记忆、反向学习和联合性学习能力受损。通过以上结果,我们得出如下结论：前额叶区NR2A亚基的过量表达,可能是通过改变NMDA受体通道动力学特性,减弱前额叶区NMDA受体的功能,从而损害前额叶区双向突触可塑性,导致小鼠出现精神分裂症样行为和前额叶相关认知功能的损伤。