论文部分内容阅读
第一部分:Xbp1s对肺动脉平滑肌细胞的生物学效应研究目的:肺动脉高压（pulmonary hypertension,PH）是一类以肺血管收缩和肺血管重构为特征的疾病,肺血管重构被认为是发病机制的中心环节。在肺血管重构过程中,肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）异常的生物学行为,如过度增殖、迁移增强、和凋亡抵抗等是造成肺血管重构的关键原因。内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是当细胞受到低氧等刺激时出现的一种保护性应激反应。本研究旨在探讨ERS过程中的强有力转录因子:剪切型X-box结合蛋白（spliced X-box binding protein 1,Xbp1s）,是否对于PASMCs在常氧和低氧培养下的生物学行为有影响并探索其具体机制。方法:将PASMCs分别在常氧、低氧（2%O2）环境中培养,通过q RT-PCR检测Xbp1s的m RNA表达水平,通过Western blot检测Xbp1s的蛋白表达水平。通过转染si RNA或质粒对Xbp1s分别进行沉默或过表达,探讨在常氧和低氧培养下沉默或过表达Xbp1s是否对PASMCs的生物学效应有影响。通过CCK8检测细胞活性,Ed U染色检测增殖,Transwell检测迁移,Annexin V/PI双染检测凋亡。通过Western blot检测沉默Xbp1s后PASMCs中增殖相关（PCNA）、迁移相关（MMP9）、和凋亡相关（Survivin、Bax、Bcl2、Caspase3（剪切型和非剪切型））蛋白的表达水平。应用DIA蛋白质谱分析来研究可能受Xbp1s调控的下游信号通路,并通过Western blot进一步验证。通过抑制Xbp1s的下游信号通路来探讨抑制此通路是否可以阻止Xbp1s的过表达对PASMCs生物学效应的影响。结果:低氧（2%O2）诱导Xbp1s在PASMCs中的表达上调。在常氧和低氧培养下沉默Xbp1s的表达可降低PASMCs的细胞活性、增殖水平、迁移水平并促进其凋亡,而过表达Xbp1s则引起与沉默相反的效应。沉默Xbp1s后增殖（PCNA）、迁移（MMP9）、和凋亡（Survivin、Bax、Bcl2、Caspase3（剪切型和非剪切型））相关蛋白的表达水平与上述生物学效应检测结果一致。通过DIA蛋白质谱检测,一系列可能受低氧和Xbp1s调控的蛋白质被发现,且差异表达蛋白的信号通路富集分析得到MAPK信号通路。进一步的验证表明p-JNK,而非p-ERK或p-p38,是Xbp1s的下游效应分子。Western blot也验证了JNK的磷酸化水平（p-JNK/JNK）随着Xbp1s的沉默而降低,并且在低氧时p-JNK表现出与Xbp1s相一致的上升趋势。进一步的,p-JNK抑制剂SP600125阻止了细胞实验中过表达Xbp1s引起的促PASMCs生存生物学效应。结论:Xbp1s在PASMCs低氧培养下表达升高,常氧和低氧培养下沉默Xbp1s减弱了PASMCs的细胞活性、增殖、迁移水平并促进凋亡,过表达Xbp1s则引起相反的效应。p-JNK介导了Xbp1s对PASMCs的生物学效应,抑制p-JNK可以阻止过表达Xbp1s对PASMCs的促生存生物学效应。第二部分:Xbp1s在低氧和MCT诱导的肺动脉高压中的作用研究目的:前期本研究已经表明剪切型X-box结合蛋白1（spliced X-box binding protein 1,Xbp1s）可以调控肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）的一系列生物学效应。因此接下来本研究将进一步在动物实验水平探索Xbp1s是否参与低氧诱导的肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension,HPH）及野百合碱（Monocrotaline,MCT）诱导的肺动脉高压（MCT induced pulmonary hypertension,MCT-PH）的发生发展。方法:在HPH模型中,将60只雄性SD大鼠随机分为5组:常氧、低氧、低氧+AAV-CTL（对照）、低氧+AAV-Xbp1s（预防）、低氧+AAV-Xbp1s（治疗）。将大鼠置于10%O2低氧环境中,每天低氧8 h,连续低氧28天诱导HPH模型。在预防和治疗组中通过气道注射1型腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）对Xbp1s在大鼠肺组织中的表达进行敲低,从而探索敲低Xbp1s的表达否可以预防和治疗HPH。在MCT-PH模型中,40只雄性SD大鼠被随机分为四组:对照、MCT、MCT+AAV-CTL、MCT+AAV-Xbp1s。通过腹腔注射MCT溶液诱导MCT-PH。通过气道注射AAV-Xbp1s来敲低Xbp1s在大鼠肺组织中的表达,从而探索Xbp1s在MCT-PH中的作用。上述两个模型造模完成后,测量右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）、体循环血压、心输出量、右心室肥厚指数等指标以评估动物PH模型血流动力学改变和右心室肥厚程度。通过HE染色并计算肺动脉增厚指数评估肺动脉血管重构。通过α-SMA和PCNA的免疫组化染色、肺小动脉TUNEL染色评估肺动脉肌化程度和组织学增殖、凋亡水平。通过Western blot、免疫荧光染色来检测Xbp1s在大鼠肺组织中的表达及定位。结果:低氧和MCT均成功诱导大鼠产生PH,表现为RVSP升高、右心室肥厚指数增加、肺总阻力增加、和肺动脉血管重构等,同时增粗的肺动脉中α-SMA、PCNA等表达增加,TUNEL染色凋亡减少;并且PH大鼠肺组织中Xbp1s的表达显著升高,AAV-Xbp1s可明显敲低Xbp1s在大鼠肺组织中的表达,显著缓解低氧和MCT诱导的PH。在HPH模型的预防组和治疗组,以及MCT-PH模型的MCT+AAV-Xbp1s组中,AAV介导的Xbp1s敲低显著降低了RVSP、右心室肥厚程度、肺总阻力、和肺动脉重构,它还降低了肺小动脉中α-SMA和PCNA的表达并恢复了肺动脉中的基础凋亡率。结论:Xbp1s在HPH和MCT-PH大鼠肺组织中表达上调,通过气道注射AAV可敲低Xbp1s在大鼠肺组织中的表达,从而缓解低氧和MCT诱导的PH,改善肺血管重构。