【摘 要】
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研究目的急性胰腺炎(AP)是临床上最常见的急症之一,具有较高的发病率和死亡率。本研究旨在探索腺泡细胞焦亡在AP中的作用及其调控的分子机制,为AP的治疗提供新的研究基础。研究方法选取C57BL/6J小鼠,腹腔注射雨蛙肽或等量生理盐水分别建立AP模型和对照。收集胰腺组织和血液标本,通过对胰腺组织HE染色、TUNEL染色、组织学评分、组织水分占比、髓过氧化物酶(MPO)水平,血清胰淀粉酶和胰脂肪酶水平检
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研究目的急性胰腺炎(AP)是临床上最常见的急症之一,具有较高的发病率和死亡率。本研究旨在探索腺泡细胞焦亡在AP中的作用及其调控的分子机制,为AP的治疗提供新的研究基础。研究方法选取C57BL/6J小鼠,腹腔注射雨蛙肽或等量生理盐水分别建立AP模型和对照。收集胰腺组织和血液标本,通过对胰腺组织HE染色、TUNEL染色、组织学评分、组织水分占比、髓过氧化物酶(MPO)水平,血清胰淀粉酶和胰脂肪酶水平检测,评估AP严重程度和腺泡细胞损伤程度。八肽胆囊收缩素(CCK8)刺激266-6细胞体外构建AP模型,检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平,评估细胞损伤程度。通过对GEO数据库中雨蛙肽诱导AP模型测序结果分析,筛选差异表达基因。通过Western Blot实验及荧光定量PCR技术检测AP模型鼠胰腺组织和经CCK8处理的266-6细胞中SPHK1表达,内质网应激相关蛋白IRE1α、PERK、ATF6活化,TXNIP表达,炎症小体相关蛋白NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2表达以及焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD活化的水平,评估SPHK1/内质网应激/TXNIP/炎症小体活化/焦亡信号通路在AP中改变。流式细胞术检测CCK8诱导266-6细胞发生焦亡比例。si-SPHK1敲低266-6细胞中SPHK1表达,4μ8c、GSK2656157、Melatonin分别抑制266-6细胞中IRE1α、PERK、ATF6活化,Ruscogenin、Z-YVAD-FMK分别抑制266-6细胞中TXNIP介导NLRP3活化、Caspase-1活化,体外观察调控上述信号通路对CCK8诱导266-6细胞损伤程度和焦亡的影响。使用SPHK1基因敲除鼠,使用GSK2656157、Ruscogenin及Belnacasan,分别体内抑制PERK活化、TXNIP介导NLRP3活化及Caspase-1活化,观察调控SPHK1、PERK活化、TXNIP介导NLRP3炎性小体活化及Caspase-1活化各自对AP严重程度和焦亡的影响。研究结果雨蛙肽诱导AP时,胰腺组织明显水肿;HE染色腺泡细胞间距显著增大且排列紊乱,同时伴随大量炎性细胞浸润,片状胰腺组织出血和坏死;组织学评分、MPO水平均显著增加,血清胰淀粉酶及脂肪酶水平亦均明显增加。胰腺组织TUNEL染色阳性细胞明显增加。CCK8处理266-6细胞后,培养基中LDH水平显著增加。GEO数据库中AP模型生信分析结果显示,鞘氨醇激酶1(SPHK1)在AP模型鼠中表达显著上调。此外,本研究亦发现AP模型鼠胰腺组织和CCK8处理的266-6细胞中SPHK1表达上调,内质网应激相关蛋白IRE1α、PERK、ATF6活化水平增加,TXNIP表达水平上调,炎症小体相关蛋白NLRP3表达上调以及焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD的活化水平增加。流式分析结果显示,CCK8刺激显著诱导266-6细胞焦亡。敲低266-6细胞中SPHK1表达,或应用GSK2656157、Ruscogenin、Z-YVADFMK分别抑制266-6细胞中PERK、NLRP3及Caspase-1活化,均可明显改善CCK8诱导266-6细胞损伤和焦亡。敲除小鼠SPHK1基因或在体内应用GSK2656157、Ruscogenin、Belnacasan抑制PERK/NLRP3/Caspase-1活化时,均可显著改善模型鼠AP严重程度和焦亡。研究结论我们的研究表明,AP时SPHK1表达上调通过内质网应激促进PERK活化,进而通过上调TXNIP表达介导NLRP3炎性小体活化,从而促进腺泡细胞焦亡参与急性胰腺炎发病。
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