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具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，F. nucleatum)是一种革兰氏阴性的专性厌氧菌，它通常存在于人口腔中，F.nucleatum通过其黏附素将口腔中的多种微生物整合在一起来发挥其致病作用。近期研究表明，F.nucleatum还与脓肿、早产、新生儿败血症、妊娠并发症相关宫内感染、炎性肠病和结直肠癌(colorectal cancer，CRC)等疾病有密切关联。在全部恶性肿瘤中，结直肠癌的发病率居第三，死亡率居第二，严重威胁人类健康。世界卫生组织(WHO)统计显示，2018年新增的结直肠癌病例约为184.6万例，CRC死亡患者逾88.3万名。有研究表明，F.nucleatum与结直肠癌组织中的淋巴结转移有正相关性，也与肿瘤的免疫逃逸、化疗耐药性有相关性。目前，F.nucleatum感染引起CRC的分子机制尚未完全阐明，因此加强研究F.nucleatum诱导的结直肠癌的致病机理，对预防和治疗结直肠癌意义重大。
MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，其长度约为19到25个核苷酸，并在转录后水平上负性调节靶基因的表达。MicroRNAs在各种生物学过程中起着重要的调节作用，并参与肿瘤细胞的若干生物学功能(例如，迁移、增殖、侵袭和分化)。先前的研究报告指出，miRNAs(例如，miR-21、miR-25和miR-92)作为癌基因或肿瘤抑制基因参与人结直肠癌的发生和进展。然而很少有研究报道，F.nucleatum感染诱导的异常表达的miRNAs在人结直肠癌中发挥了何种作用。为了探究miRNAs是否参与了F.nucleatum感染所致结直肠癌的进程，我们利用AffymetrixmiRNA和GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0生物芯片，筛选出多个与F.nucleatum所致CRC高度相关的miRNAs和mRNAs，并进行一系列分析(差异筛选、聚类分析、差异基因显著靶向性功能分析、信号转导通路分析、靶基因预测MicroRNAs与负相关基因的调控网络和基因间相互作用网络分析)，初步锁定了miR-4474、miR-4717和CREBBP在F.nucleatum感染所致的结直肠癌中可能具有重要作用；进一步，通过实时荧光定量PCR验证临床样本中相应的miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达；最后，我们采用生物信息学和双荧光素酶实验等技术验证了miR-4474、miR-4717和CREBBP之间的靶向调控关系。
【研究目的】
1.筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs；
2.探讨在F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs之间的相互作用关系。
【研究方法】
1.生物信息学方法筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs
(1)利用AffymetrixmiRNA微阵列技术和GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0，对25例CRC临床标本进行筛查。经差异筛选、聚类分析、差异基因显著靶向性功能分析和差异基因参与的信号转导通路分析等，我们筛选出差异表达的miRNAs和mRNAs。
(2 )利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR )方法检测CRC临床样本中miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达。
(3)实时荧光定量PCR分别检测F.nucleatum感染细胞模型中感染组与未感染对照组中miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达。
2.F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miR-4474/4717和CREBBP的相互关系研究
(1)生物信息学预测miR-4474/4717的下游靶基因。
(2)利用双荧光素酶实验验证miR-4474/4717对CREBBP的调控关系。
(3)分别过表达或抑制miR-4474和miR-4717，通过WesternBlot和实时荧光定量PCR观察miRNAs和CREBBP的相互关系。
【研究结果】
1.在临床标本和细胞模型中明确了F.nucleatum感染的结直肠癌组织和细胞高表达miR-4474/4717以及低表达CREBBP
(1)对25例临床标本的基因芯片筛选。结果表明，与对照组(癌旁组织)相比，感染F.nucleatum的结直肠癌组织中的miR-4474和miR-4717表达上调，而其他与癌症信号通路相关的基因，包括CREB结合蛋白质(CREBBP)表达失调。生物信息学分析发现CREBBP是F.nucleatum诱导的CRC中主要的异常表达基因。
(2)RT-qPCR方法检测临床样本的结果表明，在F.nucleatum感染阳性CRC组织中，miR-4474/4717的表达上调，CREBBPmRNA的表达下调，并且随着CRC的恶性程度，miR-4474/4717的表达逐渐升高，CREBBPmRNA的表达逐渐降低。
(3)RT-qPCR检测F.nucleatum感染细胞模型中感染组与对应未感染对照组中miR-4474、miR-4717和CREBBPmRNA的表达，其结果与临床标本结果一致。
2.明确了miR-4474/4717与CREBBP的相互作用关系
(1 )在F.nucleatum感染的结直肠癌标本中miR-4474/4717与CREBBP的表达量呈负相关。
(2)生物信息学预测miR-4474/4717的下游靶基因为CREBBP。
(3)双荧光素酶报告实验证实CREBBP是miR-4474/4717的下游靶基因。
(4 )分别过表达或抑制miR-4474和miR-4717，通过WesternBlot和RT-qPCR证实miR-4474/4717能够有效抑制CREBBP的表达。
【主要结论】
1.本研究通过基因芯片在25例结直肠癌及其癌旁组织中筛选出多个与F.nucleatum感染高度相关的miRNAs和mRNAs。
2.CREBBP是在具核梭杆菌感染相关结直肠癌组织中的关键基因。
3.F.nucleatum感染能够诱导miR-4474/4717的高表达和CREBBP的低表达。
4.CREBBP是miR-4474/4717的新靶点。
【研究意义】
本研究以基因芯片筛查临床标本为切入点，通过生物信息学方法分析筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs，并探讨了F.nucleatum诱导的CRC中差异表达的miR-4474、miR-4717及其靶基因CREBBP的相互关系。该研究为进一步理解由F.nucleatum感染引起的结直肠癌的致病机制提供了新的见解，同时也可为利用F.nucleatum作为潜在的靶点进行CRC的临床诊断、疗效监测及预后评估提供了新的思路。
MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，其长度约为19到25个核苷酸，并在转录后水平上负性调节靶基因的表达。MicroRNAs在各种生物学过程中起着重要的调节作用，并参与肿瘤细胞的若干生物学功能(例如，迁移、增殖、侵袭和分化)。先前的研究报告指出，miRNAs(例如，miR-21、miR-25和miR-92)作为癌基因或肿瘤抑制基因参与人结直肠癌的发生和进展。然而很少有研究报道，F.nucleatum感染诱导的异常表达的miRNAs在人结直肠癌中发挥了何种作用。为了探究miRNAs是否参与了F.nucleatum感染所致结直肠癌的进程，我们利用AffymetrixmiRNA和GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0生物芯片，筛选出多个与F.nucleatum所致CRC高度相关的miRNAs和mRNAs，并进行一系列分析(差异筛选、聚类分析、差异基因显著靶向性功能分析、信号转导通路分析、靶基因预测MicroRNAs与负相关基因的调控网络和基因间相互作用网络分析)，初步锁定了miR-4474、miR-4717和CREBBP在F.nucleatum感染所致的结直肠癌中可能具有重要作用；进一步，通过实时荧光定量PCR验证临床样本中相应的miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达；最后，我们采用生物信息学和双荧光素酶实验等技术验证了miR-4474、miR-4717和CREBBP之间的靶向调控关系。
【研究目的】
1.筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs；
2.探讨在F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs之间的相互作用关系。
【研究方法】
1.生物信息学方法筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs
(1)利用AffymetrixmiRNA微阵列技术和GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0，对25例CRC临床标本进行筛查。经差异筛选、聚类分析、差异基因显著靶向性功能分析和差异基因参与的信号转导通路分析等，我们筛选出差异表达的miRNAs和mRNAs。
(2 )利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR )方法检测CRC临床样本中miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达。
(3)实时荧光定量PCR分别检测F.nucleatum感染细胞模型中感染组与未感染对照组中miR-4474、miR-4717和CREBBP的表达。
2.F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miR-4474/4717和CREBBP的相互关系研究
(1)生物信息学预测miR-4474/4717的下游靶基因。
(2)利用双荧光素酶实验验证miR-4474/4717对CREBBP的调控关系。
(3)分别过表达或抑制miR-4474和miR-4717，通过WesternBlot和实时荧光定量PCR观察miRNAs和CREBBP的相互关系。
【研究结果】
1.在临床标本和细胞模型中明确了F.nucleatum感染的结直肠癌组织和细胞高表达miR-4474/4717以及低表达CREBBP
(1)对25例临床标本的基因芯片筛选。结果表明，与对照组(癌旁组织)相比，感染F.nucleatum的结直肠癌组织中的miR-4474和miR-4717表达上调，而其他与癌症信号通路相关的基因，包括CREB结合蛋白质(CREBBP)表达失调。生物信息学分析发现CREBBP是F.nucleatum诱导的CRC中主要的异常表达基因。
(2)RT-qPCR方法检测临床样本的结果表明，在F.nucleatum感染阳性CRC组织中，miR-4474/4717的表达上调，CREBBPmRNA的表达下调，并且随着CRC的恶性程度，miR-4474/4717的表达逐渐升高，CREBBPmRNA的表达逐渐降低。
(3)RT-qPCR检测F.nucleatum感染细胞模型中感染组与对应未感染对照组中miR-4474、miR-4717和CREBBPmRNA的表达，其结果与临床标本结果一致。
2.明确了miR-4474/4717与CREBBP的相互作用关系
(1 )在F.nucleatum感染的结直肠癌标本中miR-4474/4717与CREBBP的表达量呈负相关。
(2)生物信息学预测miR-4474/4717的下游靶基因为CREBBP。
(3)双荧光素酶报告实验证实CREBBP是miR-4474/4717的下游靶基因。
(4 )分别过表达或抑制miR-4474和miR-4717，通过WesternBlot和RT-qPCR证实miR-4474/4717能够有效抑制CREBBP的表达。
【主要结论】
1.本研究通过基因芯片在25例结直肠癌及其癌旁组织中筛选出多个与F.nucleatum感染高度相关的miRNAs和mRNAs。
2.CREBBP是在具核梭杆菌感染相关结直肠癌组织中的关键基因。
3.F.nucleatum感染能够诱导miR-4474/4717的高表达和CREBBP的低表达。
4.CREBBP是miR-4474/4717的新靶点。
【研究意义】
本研究以基因芯片筛查临床标本为切入点，通过生物信息学方法分析筛选F.nucleatum诱导的CRC中异常表达的miRNAs和mRNAs，并探讨了F.nucleatum诱导的CRC中差异表达的miR-4474、miR-4717及其靶基因CREBBP的相互关系。该研究为进一步理解由F.nucleatum感染引起的结直肠癌的致病机制提供了新的见解，同时也可为利用F.nucleatum作为潜在的靶点进行CRC的临床诊断、疗效监测及预后评估提供了新的思路。